Методы обнаружения, вызывающие деструкцию анализируемых веществ.

Все реагенты, используемые для обнаружения компонентов сахаров на бумажных хроматограммах (кроме реагентов, требующих промывки хроматограмм), пригодны и для тонкослойной хроматографии.

Кроме того, в ТСХ можно использовать и такие реагенты, как концентрированная серная кислота. При прокаливании пластинки, опрысканной кислотой, сахара обугливаются. Как правило, пластинку слабо опрыскивают 5—50%-ным раствором серной кислоты в воде или спирте и нагревают 10 мин при 130°С. При подобной обработке цвет сорбента не изменяется.

Для обнаружения углеводов используются также реагенты, дающие цветные реакции с сахарами и их производными:

1) анисовый альдегид + серная кислота;

2) нафторезорцин +серная кислота

3) нафторезорцин +фосфорная кислота (кетозы дают красное окрашивание, альдозы - синее);

4) азотнокислое серебро + основание;

5) кислый анилинфталат;

6) о-аминодифенил + ортофосфорная кислота;

7) дифениламин + анилин + фосфорная кислота;

8) п-анизидинфталат или хлоргидрат н-анизидина  (гексозы  дают зеленое окрашивание; пентозы — фиолетово-красное; 6-дезоксигексозы — желто-зеленое; уроновые кислоты — коричневое);

9) мочевина + фосфорная или соляная кислота;

10) хлористый 2,3,5-трифенилтетразолий;

11) бихромат калия + серная кислота;

12) азотнокислое железо(III) +солянокислый гидроксиламин;

13) перманганат калия + едкий натр;

14) карбазол + серная кислота;

15) димедон + ортофосфорная  кислота   (кетозы дают серо-зеленое окрашивание);

16) фенол+серная кислота;

17) тимол + серная кислота;

и многие другие.

3.2. КОЛИЧЕСТВЕННАЯ ТОНКОСЛОЙНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

Тонкослойная хроматография находит все большее применение для количественного определения углеводов. Этот метод чрезвычайно полезен при изучении кинетики реакций, исследовании их механизма и определении выхода продуктов, однако он применим лишь для анализа смесей, компоненты которых можно полностью разделить. Способы количественного определения делят на две большие группы:

а) прямое определение (установление количества вещества непосредственно на пластинке);

б) косвенное определение (элюирование пятен вещества с последующим анализом элюата физическими методами).

Для прямого определения используются денситометрия и радиометрия элюатов. Обе группы методов требуют построения калибровочных кривых, связывающих концентрацию компонента с интенсивностью окраски, степенью поглощения или уровнем радиоактивности соединения.

Если на каждом этапе анализа соблюдаются все меры предосторожности, точность описанных ниже методов составляет 3—5%. Измерение интенсивности окраски сахара или продуктов его распада непосредственно на хроматограмме производится методом денситометрии. Ввиду того, что сами сахара не окрашены, их обрабатывают реактивом, вызывающим появление окрашенного пятна на фоне слоя сорбента. Цвет последнего, как правило, не изменяется (белый). Если сорбент все-таки окрашивается, необходимо, чтобы окрашивание было. Пятна должны иметь четко очерченные границы и не должны выцветать. Даллас, а также Шеллард и Алам подробно рассмотрели факторы, влияющие на точность и воспроизводимость результатов анализа

Чтобы оценить содержание сахаров в образце, можно также сфотографировать хроматограмму (или сделать фотокопию) и, разрезав поученный снимок на полосы, просканировать их на денситометре.

Сахара, несущие радиоактивную метку, количественно определяют непосредственно на хроматограмме с помощью счетчика радиоактивности или радиоавтографическим методом путем денситометрического сканирования рентгеновского снимка хроматограммы.

После вымывания сахара проводят либо прямую оценку его количества, либо предварительно обрабатывают его подходящим реактивом, а затем измеряют поглощение в УФ-  или видимом свете. Трудности возникают в тех случаях, когда с сорбента элюируются посторонние вещества, мешающие измерению поглощения. Чтобы исключить возможные ошибки, необходимо тем же способом иследовать элюат образца сорбента, взятого на уровне пятна.

Сахара, несущие радиоактивную метку, количественно определяют в элюате при помощи жидкостного сцинтилляционного счетчика. Высокая точность оценки достигается даже в тех случая, когда сорбент (~0,1 г) попадает в ампулу счетчика (15 мл).

МЕТОДИКА

ПРЯМОЕ ДЕНСИТОМЕТРИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ САХАРОВ (на примере использования кукурузной патоки). Анализ проводится на стеклянных пластинках со слоем силикагеля толщиной 0,5 мм. Пластинки используются сразу после получения. Образцы кукурузной патоки с известным содержанием твердого остатка разбавляют водой до концентрации ~1 % (по этому остатку). С помощью шприца на 25 мкл, снабженного дозатором, полученный раствор наносят на пластинку полосами шириной 6 мм, содержащими от 5 до 90 мкг твердого вещества. Чтобы полосы были узкими, их подсушивают током теплого воздуха. (если образец растворяют в каком-либо органическом растворителе, раствор при подсушивании может «ползти» по внешней стороне иглы шприца, что приводит к потере вещества при нанесении). На каждой пластинке помещается 12 полос: 6 — контрольного сиропа и 6 — анализируемого.

Пластинку проявляют в подходящей системе растворителей при ~25°С; фронт растворителя должен подняться на 12 см от стартовой линии. Мальтоолигосахариды вплоть до декасахарида можно разделить в системе этилацетат—метанол—вода (37:40:23 по объему), однако этот проявитель эффективен лишь для пластинок с силикагелем F-254.

Несколько изменив состав проявителя, его можно применять и с другими сорбентами.

Пластинку высушивают в токе теплого воздуха, опрыскивают 50%-ной серной кислотой и прокаливают при 120 °С для обнаружения пятен. Чтобы полученные результаты были воспроизводимыми, пластинка должна быть равномерно опрыскана мелкими капельками распыляемой жидкости.

Количественную оценку состава смеси проводят методом трансмиссионной денситометрии на денситометре, снабженном самописцем и интегратором для определения площади каждого пика.

Пластинку сканируют в горизонтальном направлении так, что сначала регистрируются все моносахариды, затем дисахариды и т. д. Для определения площадей пиков можно также использовать планиметр. Количество каждого компонента определяют по отношению к соответствующему сахару в стандартном образце путем сравнения площадей пиков. В данном случае необходимость в использовании фильтра к лампе денситометра отсутствует.

При использовании в качестве проявителя смеси (3:4:2 по объему) этилацетат — метанол — вода, которая позволяет получить четкое разделение высших сахаров, рассматриваемый метод обеспечивает высокую точность результатов (табл.4).

Таблица 4. Состав кукурузной патоки

определенный методом бумажной и тонкослойной хроматографии

СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ (косвенный метод) Однородную суспензию 100 г восстановленной боргидридом микрокристаллической целлюлозы в 430 мл воды наносят при помощи аппликатора слоем толщиной 0,5 мм на стеклянные пластинки размером 20х20x0,4 см. Пластинки сушат при ~25 °С примерно 12 ч, после чего на них шприцем наносят по 1,25 мкл растворов сахаров. Если требуется нанести больший объем, операцию проводят в несколько приемов, подсушивая пластинку в промежутках, до тех пор, пока в пятне не окажется от 10 до 150 мкг сахара. После высушивания пластинку проявляют в течение 75 мин смесью этилацетат - пиридин - вода (2:1:2). Проявленную хроматограмму снова высушивают и равномерно опрыскивают раствором кислого анилинфталата (1,66 г о-фталевой кислоты и 0,91 мл чистого анилина растворяют в смеси 48 мл м-бутанола, 48 мл эфира и 4 мл воды). Пластинку выдерживают 5—7 мин при 105—110°С. (Внимание! Эфир.) Прямоугольные участки слоя вокруг пятен вырезают острой лопаточкой и сорбент количественно переносят с пластинки в пробирку. Размер вырезанных участков должен быть одинаковым для всех пятен одного и того же сахара. На уровне пятна сахара с пластинки берут пробу сорбента для холостого опыта. В пробирки добавляют по 0,5 мл раствора кислого анилинфталата и выдерживают 1 ч при 105—110°С. (Внимание! Эфир.) После охлаждения твердый остаток растирают тонкой стеклянной палочкой, добавив к нему 4 мл элюирующей смеси (4 мл концентрированной соляной кислоты в 100 мл ацетона). Пробирки закрывают тефлоновыми пробками и оставляют на 1 ч, периодически встряхивая. Осадок отделяют центрифугированием (3 мин), супернатанты переносят шприцем в кварцевые кюветы с l =1 см и на спектрофотометре измеряют оптическую плотность растворов относительно раствора холостого опыта при 390 нм для гексоз и 360 нм для пентоз. Зависимость оптической плотности от концентрации D-глюкозы, D-галактозы, D-маннозы, 6-дезокси-L-маннозы (L-рамнозы), D-арабинозы и D-ксилозы имеет линейный характер. Для D-ксилозы и D-глюкозы линейность сохраняется в интервале от 0 до 150 мкг. Количество сахара в образце определяют по калибровочной кривой, построенной для известных сахаров, которые были нанесены на ту же пластинку, что и анализируемая смесь. Для смесей, содержащих 20—100 мкг каждого сахара, точность определения составляет ±3%.

4. ПРЕПАРАТИВНАЯ ТОНКОСЛОЙНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

Препаративное разделение 0,05—1 г веществ методом ТСХ становится возможным при применении толстого слоя сорбента (0,5—5 мм). Этот метод используется для выделения индивидуальных сахаров в количествах, достаточных для исследования их свойств. По сравнению с колоночной хроматографией препаративная ТСХ обладает рядом преимуществ:

а) большой скоростью разделения;

б) малым количеством проявителя;

в) легкостью подбора подходящего проявителя путем пробных делений на маленьких пластинках;

г) четкостью зон и простотой их обнаружения;

д) легкостью элюирования соединений.

В препаративной ТСХ применяются те же сорбенты, что и в качественной ТСХ. Для выделения углеводов чаще всего используют силикагель, целлюлозу, кизельгур и окись алюминия. Как правило, оптимальная толщина слоя составляет 1—2 мм. Было показано, что прибавление к сорбенту различных сложных эфиров целлюлозы низкой степени замещения, а также добавление метанола к суспензии сорбента перед нанесением его на пластинку позволяют избежать появления трещин. Однако если сорбент содержит флуоресцентный индикатор, добавление метанола приводит к неравномерному окрашиванию фона. В тех случаях, когда в сорбенте присутствуют примеси, мешающие вымыванию веществ, перед изготовлением суспензии необходимо промыть сорбент хлороформом.

Образец можно нанести на пластинку несколькими способами. Чаще всего разделяемую смесь наносят в виде концентрированного раствора при помощи микропипеток и капилляров с тонким концом или шприцев. Количество смеси зависит от размера пластинки, толщины слоя, типа сорбента (например, для микрокристаллической целлюлозы 0,05 г/мм). Ширина полосы нанесенного образца не должна превышать 0,5 см. Если же она слишком велика, в ряде случаев целесообразно сконцентрировать вещество на расстоянии 1 см от линии старта путем кратковременного проявления пластинки в растворителе, в котором растворимы все компоненты смеси.

Систему растворителей для проявления выбирают на основании предварительных данных по разделению методом качественной ТСХ. Количество повторных проявлений зависит от подвижности компонентов смеси. Если хроматографирование проводится на силикагеле или окиси алюминия, обычно достаточно однократного проявления, в то время как в случае микрокристаллической целлюлозы часто требуется многократное проявление.

ОБНАРУЖЕНИЕ. Для установления положения зон на хроматограмме предложен ряд методов:

а) опрыскивание пластинки реагентами, не разрушающими сахаров, например иодом, родамином В, бромтимоловым синим, 2/,7/-дихлорфлуоресцеином или водой;

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5