2.2.2. Определение гемолитической активности комплемента

В качестве тест-объекта для определения активности комплемента in vitro
используют эритроциты барана (по классическому пути) и эритроциты кролика (по
альтернативному пути).

Активность комплемента обычно выражается в условных единицах. За одну
50 % гемолитическуго единицу (СНад) принимается количество комплемента,
необходимое для 50 %-го лизиса эритроцитов. Эта единица является условной,
поскольку зависит от концентрации эритроцитов, количества сенсибилизирующих
антител (для классического пути), величины ионной силы среды, концентрации
Са^ и mg21, ph, времени и температуры реакции. Для каждого вида рыб
подбираются оптимальные значения этих показателей.

Отношение между количеством взятого комплемента и долей лизи-рованных
клеток нс является линейным, а выражается сигмовидной кривой, для
математического описания которой используется уравнение:

Х = К (y/l-y)17"

где: Х - количество комплемента (мл) в реакции; у - степень лизиса, выраженная в
долях единицы; К -константа, соответствующая ichso при у = 0,5; 1/п-константа
(определяет наклон кривой, зависит от условий опыта).

При логарифмировании этого уравнения получается функция, удобная для
оценки результатов:

igx =lgk+l/n[lg(y/l-y)]

Зависимость величины lg Х от величины lg(y/l-y) графически будет
представлять прямую линию, по которой можно определить искомую величину К.
Зная величину К, легко рассчитать количество chsn, содержащихся в 1 мл
неразведенной сыворотки.

2.2.2.1. Определение гемолитической активности комплемента по
классическому пути активации (метод Мейера в модификации yano Т.,
1992).
- Принцип метода основан на способности комплемента присоеди-
няться к комплексу антиген - антитело (эритроциты барана - гемолизин) и
вьвывать специфический гемолиэ сенсибилизированных эритроцитов.

За единицу активности (по Мейеру) комплемента теплокровных
принимают такое количество неразведенной сыворотки, которое вызывает
50 % лизис 5х108 оптимально сенсибилизированных эритроцитов барана в
желатин - вероналовом буфере (рН 7,4), содержащем 0,15 mm Са2* и 0,5
mm mg24", в течение 60 мин инкубации при 37° С в объеме 7,5 мл. По
yano Т., в зависимости от вида рыб, инкубацию осуществляют при 20- 25°
С в течение 60-120 мин в желатин-вероналовом буфере (рН 7,3 -7,4),
содержащем 0,5 mm Са2^ и 1 mm mg^ в объеме 1,5 мл. Для сенси-
билизации эритроцитов используют гемолизин того же (или близкого)
вида рыб, что и испытуемый комплемент.

- Оборудование и реактивы: спектрофотометр и кюветы с длиной
оптического пути 1 см (при использовании приборов с иной длиной опти-
ческого пути необходимо определить и использовать в расчетах величину
оптической плотности (od) для заданной концентрации эритроцитов);
рН - метр; водяная баня; дозирующие микропипетки на 0,2; 1, 2 мл; про-
бирки (5-10 мл), выдерживающие центрифугирование; рефрижераторная
центрифуга; стерильные шприцы; глюкоза; naci; дистиллированная вода;
na-5,5,- диэтилбарбитурат (мединал); cacl2; mgcl2; желатин; in hc1;
ледяная уксусная кислота; ацетат натрия; edta; 10 % МаЖ)з; эритроциты
барана в растворе Олсвера (1:1); гемолизин;сыворотка крови рыб (источник комплемента); 0.85% naci; маточный раствор солей (СаСЬ х 2НгО - 7.35 г, mgcl-i x 6h20 - 20.33 г, дистиллированная вода до 100 мл).

- Приготовление буферных растворов:

- Вероналовый буфер, концентрат, рН 7,3-7.4 (5vb): naci - 41,5 г,
Ма-5,5-диэтилбарбитурат - 5,1 г, in hc1 - 17.5 мл, дистиллированная вода -1 л. Желатин-вероналовый буфер (gvb^): желатин - 0,1 г, 5vb - 20 мл,
маточный раствор солей - 0,1 мл, дистиллированная вода до 100 мл
(хранить при +4°С не более 1 недели) Глюкозо-желатин-вероналовый буфер (ggvb24): желатин - 0.1 г, 5vb - 10 мл, глюкоза - 2,5 г, маточный раствор солей — 0,1 мл, 10%
nanos - 0,2 мл, дистиллированная вода до 100 мл (хранить при +4° С не
более 1 недели). - 0,1 М edta буфер, рН 7<5: 2Д2 г edta растворить в 90 мл дистиллированной воды, добавляя концентрированный раствор naoh, довести рН до
7.5, долить дистиллированной воды до 100 мл. - 0,01 М edta-желатин-вероналовый буфер (edta - gvb): желатин - 0,1 г, 5 vb - 20 мл, 0,1 М edta (рН 7,5) - 10 мл, дистилированная вода до 100 мл ( хранить при +4° С не более 1 недели). 0,001 М ацетатный буфер, рН 5,0: смешать 3 части 0,1 М уксусной кислоты
с 7 частями 0,1 М ацетата натрия, развести в 100 раз, довести рН до 5,0.

- Получение гемолизина.

- Рыба. Для иммунизации используют неполовозрелую рыбу из благополучного хозяйства. Рыбу предварительно адаптируют и содержат в условиях
наиболее оптимальных для каждого вида (температура воды, проточность,
аэрация, полноценное кормление).

- Приготовление стромы эритроцитов барана. 100 мл крови барана в растворе
Олсвера (1:1) центрифугируют при 500-1000 g 10 мин (+ 4° С) и дважды отмывают
200 мл физраствора. Осадок эритроцитов лизируют в 1 л дистиллированной воды,
содержащей 0,4 мл ледяной уксусной кислоты, в течение ночи при +4° С.
Центрифугируют, затем осадок стромы промывают б раз 0,0б1 М ацетатным
буфером (рН 5,0) и 1 раз физраство-ром, центрифугируя 20 мин. при 500-1000 g.
Осадок тщательно ресус-певдируют в 30 мл физраствора. В суспензии определяют
содержание азота микромстодом Кьельдаля и доводят концентрацию до 1 мг/мл.
- Иммунизация рыб. Рыбу инъецируют в/б суспензией стромы эритроцитов
из расчета 0,3-0,5 мг n/кг массы рыбы. Инъекций повторяют многократно (6-8 раз)
с интервалом 5 дней. Перед каждой инъекцией (начиная с 4-5) отбирают
сыворотки и определяют титр гемодизина. Количество инъекций зависит от титров
полученных гемолйзинов (определение тетрагемолизина см. ниже).
- Отбор антисывороток и условия хранения. Через 5 дней после последней
инъекции стерильно отбирают максимальное количество крови. После
образования и ретракции сгустка центрифугируют 5 мин при 1500 g. Отбирают
сыворотки и разводят 1:1 gvb2^ инактивируют прогреванием (карповые-20 мин
при 50° С, лососевые - 20 мин при 42-45°С), расфасовывают и хранят при -20° С и
ниже.
- Определение титра гемолизина. Готовят серийные 2-х кратные разведения
антисывороток gvb2^ К 0,5 мл каждого разведения антисыворотки добавляют по
0,1 мл эритроцитов барана (1х109 кл/мл, см. ниже), по 0,4 мл gvb 2+ и по 0,5 мл
комплемента, разведенного gvb2^ 1:20-1:40 (в качестве комплемента используют
свежую сыворотку, полученную от интактных рыб того же вида). Смесь
инкубируют при 20 - 25° С в зависимости от вида рыб (карповые - 25°С - 60 минут,
лососевые - 20° -120 минут), центрифугируют 5 минут при 1600 g, определяют
оптическую плотность (od541) супернатанта и рассчитывают степень гемолиза. За
титр гемолизина принимают разведение, дающее 50 % гемолиз.
- Получение и условия хранения комплемента. Комплемент рыб очень
термолабилен и быстро инактивируется даже при 0° С (несколько часов), не
переносит замораживания при минус 20° С, при минус 35° С активность
сохраняется в течение месяца. Кровь после отбора оставляют на 30 мин при комнатной температуре, затем на 1 час при 0°С (лед с водой) для ретракции сгустка, центрифугируют 5 мин при 1500 g (0° ...+4° С) и отбирают сыворотки. Сыворотки как источник комплемента используют немедленно, а при необходимости хранят при -80° С или
лиофилизируют.

- Приготовление суспензии эритроцитов. Эритроциты барана в растворе
Олсвера (1:1) трижды отмывают edta-gvb и готовят 5% суспензию в gvb2^ К
0,1 мл 5 % суспензии эритроцитов добавляют 1,4 мл дистиллированной воды,
после лизиса эритроцитов измеряют ods4i против дистиллированной воды.
Необходимой концентрации эритроцитов барана 1х109 кл/мл соответствует 0d541
0,680 при длине оптического пути 1 см. Если 5 % суспензия не дает необходимого
значения od541, значит ее необходимо развести (если od541<0,680) или
сконцентрировать (если od541>0,680) во столько раз, во сколько полученное
ods4i отличается от 0,680.

- Подбор разведения гемолизина для оптимальной сенсибилизации
эритроцитов. Готовят серийные двукратные разведения гемолизина (используют
гемолизин с титром 1:1500 и выше) на gvb2'. Берут 2-4 ряда пробирок. В каждый
ряд вносят по 0,1 мл/пробирку приготовленные разведения гемолизина. Во все
пробирки добавляют по 0,1 мл суспензии эритроцитов. Встряхивают и
инкубируют при 25° С 20 мин. Готовят несколько разведении комплемента на
gvb24 - на каждый ряд свое разведение. Величина разведения зависит от вида рыб
и активности комплемента (1:15 - 1:80). В каждую пробирку ряда вносят по 1,3 мл
комплемента одного и того же разведения. Инкубируют 60 мин при 25° С (для кар-
па), 120 мин при 20° С (для лососевых), 120 мин при 25° С (для тиляпии),
периодически встряхивая. Центрифугируют 5 мин при 16ДО g, определяют od541
и рассчитывают процент гемолиза супернатанта для каждой пробирки. Для
каждого разведения комплемента строят график зависимости процента гемолиза от
разведения гемолизина. Выбирают кривую с таким разведением комплемента, при котором максимальный гемолиз составляет 50-70% (т.е. кривая выходит на плато при
гемолизе 50-70%). За оптимальное разведение гемолизнна принимают
максимальное разведение, вызывающее максимальный % гемолиза (выход кривой
на плато) и для надежности это разведение уменьшают в 2 раза (например, кривая
выходит на плато при разведении гемолизина 1:800, а за оптимальное принимают
разведение 1:400).

- Приготовление сенсибилизированных эритроцитов. Готовят оптимальное
разведение гемолизина в edta-gvb. Это разведение медленно добавляют (при
постоянном помешивании) к равному объему суспензии эритроцитов (1х109 кл/мл
в edta-gvb) и инкубируют 30 мин при 25° С. Сенсибилизированные эритроциты
отмывают в ggvb2^, центрифугируют 5-10 мин при 500g и готовят суспензию
эритроцитов в ggvb^ с концентрацией 5х108 кл/мл. Концентрацию эритроцитов
контролируют, измеряя ods4i лизированных клеток (0,2 мл суспензии
сенсибилизированных эритроцитов + 1,3 мл дистиллированной воды дают ods4i,
равную 0,680). Сенсибилизированные эритроциты хранят при +4° С в течение 1
недели.
- Техника постановки реакции и расчет активности комплемента. Все
компоненты реакции смешивают при 0° С (лед с водой). Испытуемый комплемент
разводят gvb24 в зависимости от предполагаемой его активности, чтобы попасть в
область 50% лизиса (для карпа обычно 1/40 - 1/60, для лососевых - 1/60 - 1/80).
Берут ряд из 8 пробирок. В 5 пробирок вносят разные объемы разведенного
испытуемого комплемента (0,4; 0.5; 0.6; 0.8; 1.0 мл), gvb21 доводят объем до 1,3
мл, в каждую пробирку добавляют по 0.2 мл сенсибилизированных эритроцитов.
Три пробирки используют для контролей: 1 -контроль эритроцитов на спонтанный
лизис (0.2 мл сенсибилизированных эритроцитов + 1.3 мл gvb^); 2 - 100% лизис
эритроцитов (0.2 мл суспензии сенсибилизированных эритроцитов + 1.3 мл
дистиллированной воды); 3 - контроль od.541 комплемента (1.0 мл разведенного
комплемента + 0.5 мл gvb^).

Пробирки инкубируют, периодически встряхивая (время и температура -
оптимальные для каждого вида рыб). Центрифугируют 5 мин при 1600g. Измеряют
od541 супернатанта. Вычисляют степень гемолиза (у) с учетом поправок на
контроли. Т.е. от полученного значения od.,41 супернатанта каждой опытной
пробирки вычитают od.s4i контроля эритроцитов и ods4i контроля комплемента
(значение ods^i контроля комплемента измеряют только для первой пробирки, в
которой максимальный объем комплемента, а для остальных пробирок эта
величина уменьшается пропорционально уменьшению объема комплемента).

В логарифмическом масштабе строят график зависимости у/(1 - у) от объема
комплемента. При 50% гемолизе у/(1 - у) = 1. Графически находят объем
комплемента (К), вызывающий 50% гемолиз, что соответствует 1 гемолитической
единице chso Количество СН5о в 1 мл (М) рассчитывают по формуле:

 
М = 0.2 n : К,

 где: n - величина, обратная разведению комплемента; 0.2 - коэфф. коррекции, т.к. в используемом варианте объем реакционной смеси в 5 раз меньше (1.5 мл), чем в оригинальном по Мейсру (7.5 мл). Гемолитическая активность комплемента карпа равна 20.0 ± 9.1, радужнойфорели - 28.0 ± 13.5, тиляпии - 205.1 ± 76.6. (t.yano, 1992).

2.2.2.2. Определение гемолитической активности комплемента по
альтернативному пути активации (по yano Т., 1992).

Для определения активности комплемента по альтернативному пути обычно
используют эритроциты кролика, как активатор и тест-объект. Реакцию ведут в
присутствии egta (хелатньш агент для Са2^ чтобы блокировать классический
путь активации) и mg2+.

Гемолитическая активность карпа (в отличие от радужной форели, тиляпии,
аю, порги, ' желтохвоста, человека, свиньи) возрастает в несколько десятков раз
при добавлении в реакционную смесь 0.1 mm ca2^
- Принцип метода основан на способности комплемента активироваться
эритроцитами кролика и лизировать их.
За единицу активности комплемента (АСН5о) принимают такое количество
неразведенной сыворотки, которое вызывает 50% лизис 4х10 эритроцитов при
20°С в желатин-вероналовом буфере, содержащем 10mМ egta и 10mm mg^ в
объеме 0.7 мл; рН и время инкубации различаются в зависимости от вида рыб
(радужная форель - рН 7.0, 1.5 часа; карп - рН 7.5, 1.5 часа).
- Оборудование и реактивы; оборудование см. п. 2.2.2.1.; глюкоза;
дистилированная вода; Ма-5,5-диэтилбарбитурат; mgcl2+2; in hc1;
egta; желатин; naoh; эритроциты кролика; сыворотка крови рыб (источник
комплемента).

- Приготовление буферных растворов:

- Всроналовый буфер, концентрат (5 vb), см.п, 2.2.2.1.
- 0,1 М egta - mg буфер,: egta - 38 r, mgc12 x 6 Н20 - 20,3 г, naoh – 7
r, дистилированная вода - 1л, доводят рН до 7,5 in naoh.
- 0,01 М egta - mg желатин-вероналовый буфер (egta-mg-gvb):
жедатин-0,1 г; 5 vb-20 мл; 0,1 М egta-mg-10 мл; дистилированная вода до 100
мл, доводят рН до 7,5 (для карпа), до 7,0 (для радужной форели). Хранят при +4° С
в течение 1 недели.

- Приготовление суспензии эритроцитов кролика. Эритроциты кролика в
растворе Олсвера (1:1) отмывают трижды в egta-mg-gvb и готовят суспензию с
концентрацией 2х108 кл/мл в этом же буфере. Концентрацию эритроцитов
контролируют, измеряя odw лизированных клеток (к 0,1 мл суспензии
эритроцитов добавляют 3,4 мл дистиллированной воды и измеряют od4i4 лизата;
если полученная величина od4i4 отличается от 0,740, то суспензию эритроцитов
необходимо развести или сконцентрировать во столько раз во сколько полученное
00414 отличается от 0,740).

-Получение и условия хранения комплемента см.п.2.2.2.1.
-Техника постановки реакции и расчет активности комплемента. Все
компоненты реакции смешивают при 0° С (лед с водой). Испытуемый комплемент
разводят в egta-mg-gvb в зависимости от вида рыб и предполагаемой
активности (для карпа 1/15 - 1/20, радужной форели 1/100 -1/170).
Берут ряд из 8 пробирок. В 5 пробирок вносят разные-объемы разведенного
комплемента (0,1; 0,125; 0,160; 0,20; 0,25 мл), доводят общий объем до 0,25 мл
egta-mg-gvb и добавляют в каждую пробирку по 0,1 мл суспензии эритроцитов.
Три пробирки используют для контролей: 1-контроль эритроцитов на спонтанный
лизис (0,25 мл egta-mg-gvb + 0,1 мл суспензии эритроцитов); 2 - 100 % лизис
(0,1 мл суспензии эритроцитов + 3,4 мл дистиллированной воды); 3 - контроль
комплемента (0,25 мл разведенного комплемента + 0,1 мл egta-mg-gvb).
Пробирки инкубируют 90 мин при 20° С (для карпа, радужной форели),
периодически встряхивают.

В каждую пробирку (кроме 2-го контроля) добавляют по 3,15 мл egta-mg-
gvb и центрифугируют 5 мин. при 1600g. Измеряют od4i4. Вычисляют степень
гемолиза (у) с учетом поправок на контроль эритроцитов и комплемента
(см.п.2.2.2.1.). В логарифмическом масштабе строят график зависимости у/1-у от
объема комплемента. При 50 % гемолизе у/(1-у)=1. Графически находят объем
комплемента (К), вызывающий 50 %-ньш гсмолиз, что соответствует одной
гемолитической единице АСН5и.
Количество АСН5о в 1 мл (М) рассчитывают по формуле:

Страницы: 1, 2, 3, 4