Определение уровня естественной резистентности и оценке иммунного статуса рыб

               МИНИСТЕРСТВО                                                          УТВЕРЖДАЮ
        СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА
          И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ                                            Заместитель руководителя
       РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ                                   Департамента ветеринарии
          (Минсельхозпрод России)  
 

     ДЕПАРТАМЕНТ ВЕТЕРИНАРИИ                                               В.В. Селиверстов
 

107139, Москва, Орликов пер., 1/11
       Для телеграмм: Москва, 84
    Минсельхозпрод Телекс: 41773К ЛЕН
    Телефоны: 975-58-50; 975-54-23
     № 13-4-2-/1795      от  25.11.99
 

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
    ио определению уровня естественной
    резистентности и оценке иммунного
                       статуса рыб

1.      Общие положения

Естественная рсзистентность рыб - это врожденная способность организма
противостоять агрессивному влиянию патогенных факторов биотической и
абиотической природы, в том числе, возбудителям инспекционных и инвазионных
болезней и продуктов их жизнедеятельности (экзо- и эндотоксинам). Иммунный
статус - это структурно-функциональное состояние иммунной системы в
конкретный момент жизни особи. Иммунная система рыб представляет собой
совокупность клеточных и гуморальных факторов иммунитета и состоит из клеток
лимфоидно-макрофагального комплекса (лимфоцитов, гранулоцитов, клеток
Купфера, Лангерганса и т.д.) и гуморальных компонентов (иммуноглобулины,
система компонентов комплемента, лизоцим, С-рсактивныс белки, интерферон,
лизины, гемолизины, гемагглютинины и т.п.). Клеточные элементы иммунной
системы организованы в тканевые и органные структуры. К ним относятся: тимус,
селезенка, печень, лимфоидная ткань головного и туловищного отделов почек,
скопления лимфоидной ткани черепной коробки, кишечника, перикарда,
Лейдигова и эпигональных органов. Лейдигов и эпигональные органы встречаются
только у хрящевых, а скопления лимфоидно-миелоидной ткани в черепной
коробке у хрящевых и костных ганоидов. Значительная часть
иммунокомпстентных клеток является составной частью крови и лимфы.
Иммунная система рыб отличается от таковой высших позвоночных отсутствием
лимфатических узлов, костного мозга и фабрициевой сумки (как это имеет место у
птиц); иммуноглобулины у рыб представлены, только igm подобными антителами,
тогда как у теплокровных - 5 классами (igg, igm, iga, igd, ige).

Для оценки естественной резистентности организмов рыб к заразным
болезням, используют разнообразные методические приемы анализа структурно-
функционального состояния иммунной системы. Они основаны на регистрации
показателей специфических и неспецифичсских факторов клеточного и
гуморального иммунитета.

2. Неспецифические факторы иммунитета Неспецифические факторы иммунитета участвуют в реализации функций защиты организма рыб от чужеродных тел, независимо от специфических факторов, являются естественными или врожденными компонентами организма рыб и не возникают вновь при встрече с чужеродными телами. В зависимости от структурной организации их компонентов подразделяются на клеточные и
гуморальные.

2.1. Клеточные факторы

В организме рыб они представлены разнообразными по структурной
организации клетками: лейкоцитами, макрофагами, эндотелиоцитами и т.д. Одной
из основных функций этих клеток является (фагоцитоз. Кроме того, они участвуют
в синтезе медиаторов иммунного ответа и антибиотических веществ: лизоцима,
интерферона, агглютининов, интерлсйки-нов и др.

2.1.1. Лейкоциты

Лейкоциты рыб представлены разнообразными по структуре и характеру
выполняемой функции клетками: лимфоцитами, моноцитами, нейтрофилами,
эозино- и базофилами. В основном, лейкоциты рыб, в отличие от высших
позвоночных, представлены лимфоцитами, тогда как у теплокровных - клетками
нейтрофильного ряда. У рыб на долю лимфоцитов приходится 45-99 % клеток от
общего числа лейкоцитов, а у высших позвоночных-25-30%. В 1 мл крови рыб
лейкоцитов содержится в 5-10 и более раз больше, чем у человека и животных.
Количество лейкоцитов и отдельных типов клеток, его составляющих, в организме
рыб колеблется и зависит от индивидуальных, возрастных особенностей, сезона
года, зараженности их паразитами, присутствия в воде токсических факторов и
условий содержания. На воздействие благоприятных и неблагоприятных факторов
рыбы реагируют интенсивностью лейкопоэза и изменением соотношения между
лимфоцитами и гранулоцитами. В организме рыб, подвергнутых воздействию
"агрессивных" факторов, увеличивается доля содержания клеток
гранулоцитарного ряда (палочкоядерных, ссг-ментоядерных нейтрофилов и
эозинофилов и аберрантных форм клеток).

Изменения в составе лейкоцитов отражаются на степени сопротивляемости
рыб к инфекционным и инвазионным болезням. Снижение содержания
лимфоцитов отражается на интенсивности синтеза антител, отторжения
трансплантата, завершенности фагоцитоза и напряженности иммунитета к
болезням. Существуют прямой и непрямой способы учета общего числа
лейкоцитов в крови рыб. Исследования проводят в соответствии с
"Методическими указаниями по проведению гематологического обследования
рыб", утвержденными Департаментом ветеринарии 02.02.99 г., № 13-4-2/1738.

2.1.2. Фагоцитоз

Функциональное состояние фагоцитов в большинстве случаев определяется
по фагоцитарной активности лейкоцитов периферической крови или клеток,
выделенных из головного, туловищного отделов почек и селезенки. Существуют
разнообразные методические приемы количественной оценки фагоцитарной
активности лейкоцитов. Одни основаны на подсчете числа фагоцитов с
захваченными чужеродными телами под микроскопом, другие - на регистрации
интенсивности проявления кислородзависимой антиинфекционной системы в
реакции хемилюминесцснции или по способности фагоцитов восстанавливать
растворимый краситель нитросиний тетразолий в нерастворимый диформазан
(НСТ-тест). Определение фагоцитарной активности лейкоцитов in vitro и in vivo в
отношении микроорганизмов основано на учете фагоцитов под световым
микроскопом. Хсмилюминесцентный метод определения фагоцитарной
активности клеток требует специального дорогостоящего оборудования и
компьютерной техники. Способ определения фагоцитарной реакции лейкоцитов
по НСТ-тесту более трудоемкий, чем основанный на использовании тест-
микроорганизмов. Изучение фагоцитарной активности лейкоцитов в отношении
микробов в практике лабораторных исследований чаще всего проводится in vitro и
in vivo. В качестве тест-микробов рекомендуется использовать
грамположителъные и грамотри-цательные микробы: staphilococcus aureus,
acromonas hydrophila и saccharomyces cerevisiae.

2.1.2.1. Метод определения фагоцитарной активности лейкоцитов in vitro по
Е.А. Коста и М.И. Стенко (1947).

Принцип метода. Указанный метод основан на учете соотношения числа
лейкоцитов, участвующих в фагоцитозе, и общего числа клеток белой крови.
- Оборудование и реактивы: пробирки стерильные; пипетки стерильные на
1,0 мл; пастеровские пипетки стерильные; 0,65%-ный стерильный раствор натрия
хлорида; 2%-ный стерильный раствор натрия цитрата; водяная баня,
отрегулированная на 60°С; объект фагоцитоза -одномиллиардная взвесь суточной
культуры бактерий a. hydrophila, инактивированных при 60°С в течение 30 минут,
приготовленная на 0,65%-ном стерильном растворе натрия хлорида; термостат
отрегулированный на 26°С; предметные стекла; шли4юваннос стекло; набор для
окраски мазков крови; метиловый спирт или смесь этилового спирта с эфиром ]: 1;
рабочий раствор красителя азур-эозина; иммерсионное масло;
микроскоп.
- Материал для исследования, ход определения и учет результатов. В
пробирку вносят 0,1 мл 2%-ного стерильного раствора натрия цитрата, (,|,2 мл
свсжевзятой крови от обследуемой рыбы, 0,2 мл объекта фагоцитоза. Взвесь
осторожно, но тщательно перемешивают и помещают в термостат при температуре
26°С (для теплолюбивых рыб) и более низкой (для холодолюбивых). Через 15 и 30
минут, 1; 1,5 и 2 часа с момента тер-мостатирования пастеровской пипеткой
забирают смесь из пробирки, помещают на предметное стекло и делают мазки,
которые фиксируют в течение 10 мин. смесью спирта с эфиром (1:1) или в течение
5 мин. метиловым спиртом. Затем мазки красят в течение 20-40 мин. рабочим рас-
твором азур-эозина. После этого их просматривают под иммерсией (ок.7.x об.90).
Подсчитывают 100 (иногда 50) лейкоцитов. Захватывающую способность
лейкоцитов выражают двумя показателями: процентом фагоцитоза - процентным
отношением лейкоцитов, захвативших тест-микробы, к общему числу
подсчитанных, и фагоцитарным индексом - количеством тест-микробов,
захваченных одним фагоцитирующим лейкоцитом.

2.1.2.2. Метод определения фагоцитарной активности лейкоцитов in vivo по
Г.Д.Гончарову (1966)
- Принцип метода заключается в исследовании реакции фагоцитоза
лейкоцитов в брюшной полости рыб. Анализ фагоцитарной реакции, проводится
через 15, 30, 60, 90 и 120 мин, с момента введения микроорганизмов
- Оборудование и реактивы: шприц и инъекционные иглы; 0.65%-ный
стерильный раствор натрия хлорида; водяная баня, отрегулированная на 60°С;
одномиллиардная взвесь суточной культуры бактерий А. hydrophila,
инактивированной при 60°С в течение 30 мин.; термостат, отрегулированный на
26°С; пастеровские пипетки стерильные; предметные стекла; шлифованное стекло;
метиловый спирт или смесь этилового спирта с эфиром 1:1; рабочий раствор азур-
эозина; иммерсионное масло; микроскоп.

- Материал для исследования, ход определения и учет результатов. Рыбам
между брюшными плавниками внутрибрюшинно вводят указанное количество
инактивированных микробных тел на 0,65%-ном стерильном растворе натрия
хлорида, помещают их в аквариум и через 15 и 30 мин., 1, 1.5 и 2 часа с момента
введения объекта фагоцитоза у рыб пастеровской пипеткой отбирают из места
укола брюшной экссудат, наносят на предметные стекла и делают мазки.
Полученные мазки фиксируют в течение 10 мин, смесью спирта ректификата с
эфиром (1:1) или в течение 5 мин. метиловым спиртом. Затем мазки красят в
течение 20-40 мин. рабочим раствором азур-эозина и исследуют под микроскопом
(ок.7 х об.90). Подсчитывают 100-200 лейкоцитов. Оценку проводят аналогично
методу Е.А. Коста и М.И. Стенко.

2.2. Гуморальные факторы

К гуморальным факторам иммунитета рыб относят разнообразные по
структуре и иммунобиологической функции компоненты, входящие в состав
крови, лимфы, тканевых жидкостей, кожной и кишечной слизи:
лизоцим, комплемент, агглютинины (естественные антитела), интсрфе-рон,
лсктины, трансфсрины, лизины, бактериолизины, С-реактивный белок, хитиназа и
т.д.

Ниже приведены методы определения бактерицидных свойств сыворотки
крови (БАСК), комплемента, интерферона и естественных антител или
агглютининов, наиболее объективно отражающих функциональное состояние
иммунной системы и уровень естественной резистент-ности рыб.

2.2.1. Определение бактерицидной активности сыворотки (БАСК)
крови рыб

БАСК отражает функциональное состояние гуморальных факторов защиты
или естественной резистснтности. Данный показатель используют при оценке
характера течения инфекционного процесса, зараженности рыб паразитами и
условий нагула. Для учета величины антимикробных свойств сыворотки крови
рекомендуется использовать радиоуглеродный и фотоэлсктронефелометрический
способы. Поскольку для оценки БАСК радиоуглсродным способом требуется
специально приспособленное для этой цели оборудование рекомендуется
пользовать оптический метод (О.В.Смирнова, Т.А.Кузьмина, 1966),
адаптированный для рыб (Микряков и др. 1979: Зимин, 1983).

Принцип метода основан на учете характера изменения оптической
плотности МПБ или РПБ при росте на нем микробов с добавлением или без
добавления испытуемой сыворотки с помощью фотоэлектрического колориметра
или спектрофотометра.

Оборудование и реактивы: пипетки стерильные на 1,0 мл; МПБ или РПБ
стерильный в пробирках по 2,5 и 3,0 мл или по 5,0 и 6,0 мл; сыворотка крови
исследуемых рыб; одномиллиардная взвесь суточной культуры вирулентных
бактерий a. hydrophila (можно использовать и другие виды микроорганизмов),
приготовленная на 0,65%-ном стерильном растворе натрия хлорида; термостат,
отрегулированный на 26°С; ФЭК-56М; пастеровские пипетки, шприцы и
инъекционные иглы для взятия крови, стерильные.

Материал для исследования, ход определения и учет результатов. Оценку
БАСК проводят в течение 1-5 суток от момента взятия крови. Кровь для получения
сыворотки собирают в стерильные пробирки каудоэкгомией, отсечением
жаберных артерий или из кровеносных сосудов хвостового стебля с помощью
пастеровской пипетки или шприца. Полученную кровь отстаивают при комнатной
температуре 20-30 минут. После обведения сгустка крови с помощью стерильной
пастеровской пипетки пробирки ставят в холодильник на 18-24 часа при + 4° С.
Через сутки отделившуюся в пробирках сыворотку пастеровскими пипетками
отсасывают и переносят в стерильные пробирки. Далее сыворотку
центрифугируют при 3000 об/мин, в течение 10-15 минут и используют для
постановки опыта. В пробирки вносят 2,5 мл МПБ или РПБ и 0,5 мл испытуемой
сыворотки, а в три контрольные пробирки 3,0 мл среды. Затем пастеровской
пипеткой во все пробирки добавляют по 2 капли одномиллиардной взвеси
суточной культуры тест - бактерий. Содержимое пробирок тщательно
перемешивают, отбирают по 3.0 мл смеси и определяют оптическую плотность на
ФЭК. После этого пробы помещают в термостат при 26°С на 3 часа, после чего
вновь измеряют оптическую плотность их содержимого. В пробирках с активной
сывороткой крови оптическая плотность остается на прежнем уровне или
незначительно повышается. При слабой бактерицидной активности сыворотки
оптическая плотность среды возрастает за счет накопления в ней размножающихся
микробов. В контрольных пробирках оптическая плотность среды возрастает.
БАСК выражают через изменения оптической плотности контрольных и
подопытных проб, отражающие угнстсние роста бактерий в присутствии
сыворотки, и рассчитывают по формуле:

БАСК(%) = 100 х -dek ~ de ° ,

 где de, d Ек - разность оптической плотности второго и первого измерений в
контрольных пробирках; deo - разность оптической плотности второго и первого измерений оптической плотности в опытных пробирках.
100-коэффициснт перевода оптической плотности в %.

Страницы: 1, 2, 3, 4