Среды, содержащие белки, дающие характерные изменения под действием бактериальных ферментов (кровь, желатина, молоко и др.), применяют для определения гемолитических или протеолитических свойств. Наиболее распространены мясопептонная желатина (МПЖ), свер­нувшаяся лошадиная сыворотка, молоко и кровяной агар (КА).

Среды, содержащие углеводы или многоатомные спирты. Ферментативное расщепле­ние субстратов приводит к сдвигу рН и изменению окраски среды, а иногда и образованию газа. Наиболее распространены цветные среды с различными углеводами (например, с бром-тимоловым синим, индикатором ВР), лакмусовое молоко (среда Минкевича) и среды Хисса. Из углеводов наиболее часто используют моносахариды (ксилозу, арабинозу, глюкозу, фруктозу, маннозу, галактозу), дисахариды (лактозу, мальтозу, сахарозу), полисахари­ды (крахмал, гликоген, инулин, декстрин), спирты (дульцит, маннит, сорбит, глицерин) и гликозиды (адонит, инозит, салицин, амигдалин).

Среды для определения редуцирующей способности. В эту группу входят среды с крас­ками, обесцвечивающимися при восстановлении (например, метиленовый голубой, нейтраль­ный красный, индигокармин), а также среды с нитратами для определения денитрифицирую­щей активности бактерий (при положительном результате среды окрашиваются в синий цвет).

Среды, включающие вещества, ассимилируемые только определённой группой бактерий. Наиболее известны цитратный агар Симмонса и цитратная среда Козера.

Посев и культивирование

При достаточном содержании патогенных бактерий в образце проводят посев на плотные пита­тельные среды (для получения изолированных колоний). Если в исследуемом материале бактерий мало, то посев проводят на жидкие среды обогащения. На практике выделение относительно неприхотливых бактерий обычно проводят на простых средах (например, на КА, агаре Плоскирева, тиогликолевом бульоне, агаре Сабуро и т.д.). Для выделения прихотливых видов в среды вносят питательные вещества (кровь, сыворотку, дрожжевой экстракт и др.), а также погло­тители токсических метаболитов, образующихся при росте бактерий (например, дре­весный уголь). Для посевов применяют микробиологические петли, реже иглы и шпатели.

Получение изолированных колоний

Для получения изолированных колоний на практике наиболее часто используют модифика­цию рассева по Дригальски. Для этого материал наносят на поверхность плотной питательной среды ближе к краю и делают «бляшку». Затем из неё материал распределяют по четырём квадратам, проводя петлёй штрихи, как показано на рис. 1-12, обжигая петлю после засева каждого квадрата. Подобный метод позволяет получить изолированные колонии и изучать их. Исключение составляет техника посева при бактериологическом исследовании мочи (техника штрихового засева показана на рис. 1-13). Указанные методы пригодны для посева аэробных и факультативно анаэробных бактерий, а также нестрогих анаэробов.

Температура культивирования

Патогенные бактерии вариабельны в отношении температур, оптимальных для их роста, но большинство из них неплохо развивается при 35-37 °С. Исключение составляют некоторые атипичные микобактерии, возбудитель чумы, листерии и лептоспиры (температурный оптимум 20-30 °С), а также Campylobacter jejuni (температурный оптимум 42 °С).

.

Состав  газовой среды

Бактерии чётко разделяют по отношению к содержанию кислорода в атмосфере культиви­рования.

Аэробы. Посевы аэробных бактерий культивируют в простых термостатах. Некоторые факуль­тативно анаэробные виды также можно культивировать при атмосферном воздухе, но более оптимально помещение посевов в термостаты с дозированной подачей кислорода. На практи­ке их чаще помещают в эксикаторы, куда вносят горящую свечу; после её выгорания в атмо­сфере снижается содержание кислорода и повышается содержание СО2.

Анаэробы. Посевы анаэробных бактерий в жидких средах заливают вазелиновым или другим маслом. При использовании плотных сред посевы культивируют в специальных устройствах — анаэростатах (откуда откачивают воздух) либо заливают посевы тонким слоем агара. Анаэ­робные условия можно создать химическим путём, поместив посевы в эксикаторы, на дно которых заливают щелочной раствор пирогаллола, поглощающего кислород. Также можно использовать методы Фортнера, Цейсслера и Вейнберга.

Метод Фортнера. Посевы проводят на чашку Петри с толстым слоем среды, разделённым пополам узкой канавкой, вырезанной в агаре. На одну половину засевают культуру аэроб­ных бактерий, на другую — анаэробных. Края чашки заливают парафином и инкубируют в термостате. Первоначально наблюдают рост аэробов, а затем (после поглощения кислоро­да) — рост анаэробов.

Метод Цейсслера используют для выделения чистых культур спорообразующих анаэробов. Для этого проводят посев на среду Китта-Тароцци, прогревают 15 мин при 80 °С (для унич­тожения вегетативных форм), заливают вазелиновым маслом и инкубируют 24 ч. Затем про­водят посев на сахарно-кровяной агар для получения чистых культур. После 24-часового культивирования подозрительные колонии изучают и отсевают на среду Китта-Тароцци (с последующим контролем чистоты выделенной культуры).

Метод Вейнберга используют для получения чистых культур строгих анаэробов. Культуры, выращенные на среде Китта-Тароцци, вносят в сахарный бульон. Затем пастеровской пи­петкой с запаянным концом материал переносят в узкие пробирки (трубки Виньяля) с сахарным МПА, погружая пастерку до дна пробирки. Засеянные пробирки быстро охлаждают холодной водой, что позволяет зафиксировать отдельные бактериальные клетки в толще затвердевшего агара. Пробирки инкубируют, и изучают выросшие колонии. При обнаружении подозрительной колонии на её месте делают распил, колонию быстро отбирают и засеивают на среду Китта-Тароцци (с последующим контролем чистоты выделенной культуры).

                               1

  Методы культивирования

 При выращивании бактерий применяют стационарный способ, способ глубинного культивирования с аэрацией и метод проточных питательных сред. В соответствии со способами выращивания бактериальные культуры разделяют на периодические (при стационарном и глубинном культивировании) и непрерывные (при проточном культивировании).

Стационарный способ — наиболее часто используемый на практике. Состав сред остаётся постоянным, с ними не проводят никаких дополнительных манипуляций.  

Способ глубинного культивирования применяют при промышленном выращивании бактериальной биомассы, для чего используют специальные котлы-реакторы. Они снабжены систе­мами поддержания температуры, подачи в бульон различных питательных веществ, переме­шивания биомассы и постоянной подачи кислорода. Создание аэробных условий по всей толще среды способствует протеканию энергетических процессов по аэробному пути, что способствует максимальной утилизации энергетического потенциала глюкозы и, следователь­но, максимальному выходу биомассы.

Метод проточных сред (промышленный способ культивирования) позволяет постоянно под­держивать бактериальную культуру в экспоненциальной фазе роста, что достигают постоянным внесением питательных веществ и удалением определённого числа бактериальных клеток. Пре­бывание бактерий в экспоненциальной стадии роста обеспечивает максимальный выход различ­ных БАВ (витамины, антибиотики и др.).

Первичная идентификация бактерий

В большинстве случаев изучение особенностей роста для первичной идентификации возбу­дителей проводят на колониях, выросших в течение 18-24 ч. Характер роста бактерий на раз­личных средах может дать много полезной информации. На практике используют сравнительно небольшой набор критериев. В жидких средах обычно учитывают характер поверхностного (образование плёнки) или придонного роста (вид осадка) и общее помутнение среды. На твёр­дых средах бактерии формируют колонии — изолированные структуры, образующиеся в результате роста и накопления бактерий. Колонии возникают как следствие роста и размноже­ния одной или нескольких клеток. Таким образом, пересев из колонии в дальнейшем даёт возможность оперировать с чистой культурой возбудителя. Рост бактерий на плотных сре­дах имеет больше характерных особенностей.

Гемолиз

Некоторые бактерии выделяют гемолизины — вещества, разрушающие эритроциты. На КА их колонии окружают зоны просветления. Образование гемолизинов (и соответственно — раз­меры зон гемолиза) может быть вариабельным, и для адекватного определения гемолитической активности следует просматривать чашки с посевами против источника света (рис. 1-14). Активность гемолизинов может проявляться в полном или неполном разрушении эритроцитов.

 α-Гемолиз. Разрушение эритроцитов может быть неполным, с сохранением клеточной стромы. Подобный феномен называют α-гемолиз. Просветление среды вокруг колоний обычно незначительно, позднее среда вокруг колоний может приобретать зеленоватую окраску. Подобный рост характерен для пневмококка, а также для группы так называемых зеленя­щих стрептококков.

β-Гемолиз. Гораздо большая группа бактерий вызывает полное разрушение эритроцитов, или β-гемолиз. Их колонии окружены прозрачными зонами различного размера. Например, Streptococcus pyogenes и Staphylococcus aureus образуют большие зоны гемолиза, a Listeria monocytogenes или Streptococcus agalactiae — небольшие, диффузные зоны. Для определения гемолитической активности не следует применять шоколадный агар (ША), так как образующи­еся зоны α- или β-гемолиза не имеют характерных особенностей и вызывают одинаковое позеленение среды.

Размеры и форма колоний

Важные признаки колоний — их размеры и форма. Колонии могут быть большими или мелкими. Величина колоний — признак, позволяющий различать различные виды, роды и даже типы бактерий.

В большинстве случаев ко­лонии грамположительных бактерий мель­че колоний грамотрицательных бактерий. Колонии бактерий могут быть плоскими, приподнятыми, выпуклыми, иметь вдавлен­ный или приподнятый центр. Другой важный признак — форма краёв колоний. При изучении фор­мы колоний учитывают характер её поверх­ности: матовый, блестящий, гладкий или ше­роховатый. Края колоний могут быть ров­ными, волнистыми, дольчатыми (глубоко изрезанными), зубчатыми, эрозированными, бахромчатыми и т.д. Размеры и формы ко­лоний часто могут изменяться. Подобные изменения известны как диссоциации. Наиболее часто обнаруживают S- и R-ducсоциации. S-колонии круглые, гладкие и выпуклые, с ровными краями и блестящей поверхностью. R-колонии — неправильной формы, шероховатые, с зубчатыми краями.

Цвет колоний

При просмотре посевов также обращают внимание на цвет колоний. Чаще они бесцветные, белые, голубоватые, жёлтые или бежевые; реже — красные, фиолетовые, зелёные или чёрные. Иногда колонии ирризируют, то есть переливаются всеми цветами радуги [от греч. iris, радуга]. Окрашивание возникает в результате способности бактерий к пигментообразованию. На специ­альных дифференцирующих средах, включающих специальные ингредиенты или красители, ко­лонии могут приобретать разнообразную окраску (чёрную, синюю и др.) за счёт включения красителей либо их восстановления из бесцветной формы. В данном случае их окраска не связана с образованием каких-либо пигментов.

Консистенция колоний и особенности роста на среде

Полезную информацию могут дать консистенция колоний и особенности роста на среде. Обычно эту информацию можно получить при прикосновении к колониям петлёй. Колонии могут легко сниматься со среды, врастать в неё или вызывать её коррозию (образуя трещины и неровности). Консистенция колоний может быть твёрдой или мягкой. Мягкие колонии — маслянистые или сливкообразные; могут быть слизистыми (прилипают к петле) или низкими (тянущимися за петлёй).

Твёрдые колонии — сухие, восковидные, волокнистые или крошковатые; могут быть хрупкими и ломаться при прикосновении петлёй.

Запах

Запах — менее важный признак колоний, поскольку вызываемые им ассоциации носят субъективный характер. В частности, культуры синегнойной палочки имеют запах карамели,           культуры листерий — молочной сыворотки, протеев — гнилостный запах, нокардий — свежевскопанной земли.

 Биохимические методы идентификации бактерий

 Методов, используемых для идентификации особенностей метаболизма бактерий, очень много, но на практике применяют небольшое их количество. Большинство способов основано на использовании дифференциально-диагностических сред, включающих различные индикаторы.

  Способность к ферментации углеводов

Способность к ферментации углеводов оценивают по изменению окраски среды вследствие образования органических кислот (соответственно, происходит уменьшение рН), вызывающих изменение окраски индикатора.

«Пёстрый» ряд. Для определения сахаролитической активности применяют среды Хисса; в их состав входят 1% пептонная вода (или МПБ), индикатор Андраде и один из углеводов. При расщеплении углевода происходит изменение цвета среды с жёлтого на красный. Поскольку бактерии различают по способности ферментировать те или иные углеводы, то ряды пробирок приобретают пёстрый вид. Поэтому этот набор сред и называют «пёстрый» (или цветной) ряд.

Стеклянные поплавки. Для определения способности микроорганизмов ферментировать уг­леводы с образованием кислоты и газа в сосуды со средами вносят стеклянные поплавки (запаянные с одного конца короткие трубочки), всплывающие после наполнения их газом.

Расщепление белков

Некоторые бактерии проявляют протеолитическую активность, выделяя протеазы, катализи­рующие расщепление белков. Наличие протеолитических ферментов из группы коллагеназ оп­ределяют при посеве уколом в МПЖ. При положительном результате наблюдают его разжиже­ние в виде воронки либо послойно сверху вниз. Способность к расщеплению белков и амино­кислот также можно оценивать по изменению окраски среды, так как образующиеся продукты — аммиак, индол и сероводород — сдвигают рН в щелочную сторону, вызывая изменение окраски индикатора.

Образование аммиака. Для определения способности к образованию NH3 проводят посев в МПБ, и между его поверхностью и пробкой закрепляют полоску лакмусовой бумаги. При положительном результате бумажка синеет.

Образование индола и H2S. Обычно для определения способности к образованию индола и сероводорода также проводят посев в МПБ, между его поверхностью и пробкой закрепляют бумажки: в первом случае пропитанные раствором щавелевой кислоты {при образовании индола бумажка краснеет), во втором — раствором ацетата свинца (при образовании H2S бумажка чернеет). Также используют специальные среды, содержащие индикаторы (напри­мер, среда Клиглера), либо их вносят непосредственно в среду после регистрации видимого роста бактерий.

Тест на нитратредуктазную активность

Этот тест используют для идентификации отдельных видов бактерий. Он позволяет опреде­лить способность восстанавливать нитраты в нитриты. Способность к восстановлению NO3 в N02, определяют культивированием в МПБ, содержащем 1% раствор KNO3. Для определения нитритов в среду добавляют несколько капель реактива Грисса. При положительном резуль­тате наблюдают появление красного кольца.

Хроматография

Хроматографические методы используют для идентификации бактерий и установления их систематического положения. Объекты для исследования — жирные кислоты клеточной стенки, уникальные интермедиаты и конечные метаболиты жизнедеятельности бактерий. Хроматографические системы обычно сопрягают с компьютерами, что значительно упрощает учёт результатов. Наиболее распространена идентификация жирных короткоцепочечных и тейхоевых кислот методом газожидкостной хроматографии. Жидкостной хроматографией под высоким давлением идентифицируют миколевую кислоту в клеточных стенках микобактерий. Тонкослойную хроматографию используют для идентификации изопреноидных хинонов клеточной стенки бактерий. У различных родов их содержание и набор различны, но постоянны, что позволяет установить систематическое положение каждого конкретного вида.

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5