35.                    Химический синтез. Синтез всего многообразия органических веществ из карбоната — классическая задача органической химии. Знаменитые цепочки превращений органических соединений (кошмар многих поколений студентов и школьников) в полной мере реализованы в синтезе 14C-соединений. Все органические соединения, которые не удается получить биосинтезом, синтезируют химически.

Схема распада углерода-14: 14C —> 14N + e. Хотя с детекцией 14C особых проблем не возникает, применение 14C-соединений в life science крайне ограничено. Это связано с очень низкой молярной активностью 14C-соединений, и даже кратно меченые молекулы не меняют ситуацию радикально. Обычно молярная активность 14C-соединений не превышает 20÷50 мКи/ммоль, (у соединений трития почти в 1000 раз выше, а у фосфора-32 или 33 еще в 100 раз выше) и, следовательно, по чувствительности методы с использованием 14C-соединений значительно уступают методам, в которых используют 3Н-соединения. На сегодняшний день 14C-соединения прочно удерживают за собой только одну "нишу" в life science — это изучение метаболизма новых лекарственных (или косметических) препаратов. Для изучения деградации, накопления в органах, скорости и путей выведения, биодоступности и прочих аспектов метаболизма равномерно меченые 14C-соединения остаются востребованными, несмотря на очень высокую стоимость и трудоемкость синтеза.

8. Радионуклиды 32P и 33P

Радионуклиды 32P и 33P — очень удобны для life science, но их применение ограничено природой, т.к. фосфор в природных органических соединениях присутствует гораздо реже, чем водород, углерод или кислород.

Получение радиоактивных изотопов фосфора (32Р и 33Р) с технической точки зрения одинаково: облучение элементарной серы особой чистоты в ядерном реакторе.

Однако, с экономической точки зрения разница колоссальная. Дело в том, что 32Р получают по реакции 32S + 0n —> 32P + 1p в виде 32P-ортофосфата. Стартовый материал мишени — природная элементарная сера, содержащая более 92% стабильного изотопа 32S. Изотоп 33Р получают по реакции 33S + 0n —> 33P + 1p также в виде 33P-ортофосфата. Но мишенью для этой реакции служит изотоп 33S, содержание которого в природе составляет доли процента. Для получения 33Р высокого качества необходимо использовать для облучения только 33S с обогащением не ниже 98,5÷99,0%. Это сразу существенно увеличивает стоимость продукта, т.к. стоимость обогащенной серы-33 больше природной серы примерно на 6 порядков (в миллион раз). Поэтому соединения фосфора-33 всегда будут дороже аналогичных соединений, меченных фосфором-32.

Схемы распада радионуклидов фосфора : 32P —> 32S + e и 33P —> 33S + e

Исходным радиоактивным сырьем для получения соединений, меченных радиоактивными изотопами фосфора, всегда является ортофосфорная кислота (32Р или 33Р соответственно). Так как химия и биохимия 32Р и 33Р абсолютно одинаковы, в дальнейшем речь пойдет о фосфоре-32, с учетом того, что все это распространяется и на фосфор-33. В особых случаях, когда необходимо, будут отмечаться различия. Собственно сама 32Р-орто-фосфорная кислота в life science используется редко. Обычно это выращивание микроорганизмов (бактерий или дрожжей) или культуры клеток в среде, содержащей 32Р-ортофосфат. Полученную меченую биомассу отделяют от культуральной жидкости, а затем исследуют. Несколько замечаний по этому процессу.

36.                    Исходная 32Р-ортофосфорная кислота без носителя (этот термин означает, что в препарат не добавляли специально нерадиоактивную ортофосфорную кислоту) имеет молярную активность не менее 5000 Ки/ммоль, и, соответственно, концентрация собственно фосфата в среде только за счет радиоактивного фосфора будет не выше 10-8 М. Для биологических (микробиологических) работ такая концентрация фосфата в среде слишком низкая — клетки будут "считать", что фосфора нет вообще. Поэтому в культуральную среду обязательно добавляется "холодный" фосфат в концентрации, необходимой для усваивания. Обычно это не ниже 10-4 М. Не пытайтесь "включить" радиоактивный фосфат в культуру клеток без "холодного" носителя. Часть радиоактивного фосфата просто сорбируется на поверхности посуды или клеток, а включения в клеточный обмен не произойдет.

37.                    Оптимальная концентрация фосфата для таких экспериментов подбирается индивидуально для разных задач и видов клеток. "Переносить" данные по оптимальной концентрации с одного вида экспериментов (или клеток) на другой надо осторожно.

Основными соединениями фосфора-32, применяемыми в life science, являются нуклеозид-5'-трифосфаты, меченные в альфа или гамма положении. В конце 60-х — начале 80-х годов ХХ века было разработано несколько способов синтеза этих соединений, но после работы Джонсона и Валсеса, предложенный ими ферментативный способ стал рутиной как для лабораторного синтеза, так и для масштабного производства. Химические методы синтеза меченных фосфором-32 соединений используются, когда нет ферментативного пути, например для синтеза синтетических аналогов нуклеотидов.

Измерение активности радионуклидов 32Р и 33Р — операция достаточно простая — любой жидкостной сцинтилляционный β-счетчик считает 32Р и 33Р с эффективностью не ниже 90%. Для фосфора-32 использование сцинтиллятора совсем не обязательно. Обычно измерение фосфора-32 проводят за счет "свечения Черенкова" — эффекта, обусловленного взаимодействием высокоэнергетических электронов с окружающей средой. Не вдаваясь в физические аспекты Черенковского свечения, следует знать, что сцинтилляционные счетчики "считают" фосфор-32 без всякого сцинтиллятора с эффективностью около 30%. Черенковское свечение фосфора-32 можно легко увидеть. Нанесите на подложку (пластинку ТСХ или фильтровальную бумагу) 1 мкл раствора 32Р-ортофосфорной кислоты (или любого другого соединения фосфора-32) с активностью 50 мкКи (около 2МБк) и поместите подложку между плоскостями двух кусков обычного стекла, толщиной 4÷5 мм. В темноте (только без "красного" света) через 3÷5 мин. адаптации глаза будет хорошо видно зеленовато-голубое свечение пятна, соответствующего точке нанесения раствора на подложку. Не подносите такой источник близко к глазам — все прекрасно видно с расстояния 40÷60 см.

Весьма полезным для работы является возможность измерения фосфора-32 прямо в пластиковых пробирках, помещенных в стандартный сцинтилляционный флакон. На практике это означает, что вы можете измерять активность своего образца, например, вырезанный кусок из агарозного геля или пробирку с фракцией элюата хроматографического разделения, а затем использовать образец для дальнейшей работы. Такая особенность фосфора-32 является его важнейшим преимуществом перед другими β-радионуклидами, применяемыми в life science. Все остальные β-радионуклиды, приведенные выше в таблице 1, включая фосфор-33, требуют для измерения в сцинтилляционном счетчике прямого контакта с сцинтилляционной жидкостью, т.е. добавления образца прямо во флакон, содержащий сцинтиллятор. Естественно, после этого образец для дальнейшей работы теряется.

Среди радионуклидов, применяемых в life science, фосфор-32 является "рекордсменом" по чувствительности методик с его использованием. Однако, простой расчет чувствительности метода (поделите обычный предел обнаружения фосфора-32, т.е. около 3÷4 Бк, на максимальную молярную активность используемого соединения, т.е. около 2х1017 Бк/моль) показывает величину около 10-17 моля. К сожалению, это неправильно. Причина этого в высоком "биологическом" фоне. Например, при постановке ДНК-полимеразной реакции контрольная проба, в которую добавляют все компоненты реакции кроме фермента, также показывает некоторое "включение" радиоактивного фосфора в ДНК, на самом деле обусловленное просто неспецифической сорбцией радиоактивного предшественника биосинтеза. Такая неспецифическая сорбция есть всегда в любом биохимическом эксперименте и фактически чувствительность метода будет определяться величиной этого "биологического" фона. Например, в реакцию добавлено 0,1 МБк [α-32P] dNТР (это примерно 2х106 срм по Черенкову), ферментативое включение в ДНК около 30%, а неспецифическая сорбция — фон — составляет около 0,1%, т.е. 2х103 срм. Граница достоверности определяемой величины будет определяться именно неспецифической сорбцией (в этом примере 2х103 срм), которая обычно гораздо выше фона измерительной аппаратуры. В этом примере фон 2000 срм, и, следовательно, достоверная величина измеряемого эффекта должна быть не ниже 6000 срм, что в 30 раз снижает чувствительность по сравнению с "идеальной" расчетной.

Использование фофора-32, а позднее и фосфора-33, начиналось еще в 50-х годах ХХ века, однако после разработки методов секвенирования ДНК с помощью фосфора-32 спрос на соединения, меченные фосфором-32, достиг просто огромных величин. В "пике" потребления нуклеотиды, меченные фосфором-32, производились в мире в объеме несколько десятков кюри ежемесячно (это десятки тысяч фасовок каждый месяц), и только флюоресцентные методы секвенирования спустили потребление радиоактивного фосфора с заоблачных высот к нынешнему состоянию.

Традиционно меченые фосфором нуклеотиды используются по нескольким направлениям:

38.                    Введение в ДНК (РНК) за счет нуклеозид-5' — [α-32Р]-трифосфатов и изучение соответствующих ферментов.

39.                    Введение в олигонуклеотиды 32Р фосфорилированием 5'-конца с помощью [γ-32P] ATP и полинуклеотидкиназы.

40.                    Фосфорилирование белков протеинкиназами с помощью [γ-32P] ATP.

Наиболее востребованным меченым соединением фосфора-32 является аденозин-5'-[γ-32P] трифосфат, который обычно сокращенно обозначают [γ-32P] АТР. Это вполне объяснимо, т.к. кроме широко известной методики введения 32Р-метки на 5'-конец олигонуклеотида с помощью Т4 полинуклеотидкиназы, [γ-32P] АТР используют для изучения различных фосфотрансфераз (киназ), в том числе и для биоскрининга химических библиотек протеин-киназными тестами. Нуклеозид-5'трифосфаты, меченные фосфором-32 в α-положении, сокращенно обозначают [α-32Р] NТР или [α-32Р] dNТР (рибо- или 2'-дезоксирибонуклеотиды соответственно) и используют, в основном, для введения "метки" в нуклеиновые кислоты с помощью РНК- или ДНК-полимераз. Естественно, сюда же примыкают исследования биосинтеза нуклеиновых кислот и их ферментативного аппарата. Технология введения 32Р-метки в нуклеиновые кислоты подробно изложена в "классике методов" ( Маниатис Т. Фрич Э. Самбрук Дж. "Молекулярное клонирование" М. "Мир" 1984 г.). Поэтому я отмечу только некоторые характерные для начинающих ошибки.

Вполне естественное стремление каждого исследователя получить меченый препарат ДНК (например ДНК-зонд для гибридизации) с максимальной удельной активностью имеет свои ограничения. Считается, что препарат ДНК, имеющий удельную активность не менее 108 срм на мкг ДНК, "пометился" хорошо и может дать при гибридизации чувствительность, близкую к максимальной. Если удельная активность препарата 107÷108 срм на мкг ДНК, то результат получится весьма посредственный, а если синтезированный вами препарат имеет удельную 106 срм на мкг ДНК, то вы что-то сделали неправильно — такой препарат к работе мало пригоден.

Еще одна характерная ошибка начинающих исследователей — попытка синтеза высокомеченного ДНК-зонда с помощью замены нерадиоактивных dNTP на [α-32Р] dNТР. К сожалению, попытки использовать для синтеза меченой ДНК 2÷3, а иногда и всех 4-х меченых [α-32Р] dNТР вместо одного, заранее обречены. В лучшем случае использование двух меченых [α-32Р] dNТР даст почти такой же результат (как правило, все-таки немного ниже) как использование одного [α-32Р] dNТР. В остальных вариантах, независимо от конкретных нуклеотидов, удельная активность такой 32Р-ДНК будет существенно ниже. Это обусловлено двумя причинами. Во-первых, оптимальная концентрация dNTP для синтеза меченой ДНК не ниже 10 мкМ (часто делают ещё выше), а молярная концентрация меченого [α-32Р] dNТР в реакции — примерно 0,2÷0,4 мкМ. Замена "холодного" dNTP на [α-32Р] dNТР снижает концентрацию в 20÷40 раз. Следовательно, замена всех dNTP на радиоактивные [α-32Р] dNТР снижает концентрацию всех предшественников биосинтеза до величин ниже Км (константы Михаэлиса) для каждого dNТР, что в данном случае почти останавливает реакцию. Во-вторых, химическая чистота "холодных" dNTP, как правило, выше [α-32Р] dNТР и, соответственно, количество примесей, способных ингибировать ДНК-полимеразу, возрастает, если заменять все dNTP на соответствующие [α-32Р] dNТР.

Аналогичная ситуация наблюдается и при использовании [α-32Р] NТР в синтезе РНК. Так как величина Км большинства РНК-полимераз находится в интервале 10÷100 мкМ, то использовать [α-32Р] NТР без добавления в реакцию "холодного" трифосфата до приемлемой концентрации бессмысленно — реакция не идет. Более того, РНК-полимеразы более "капризны", чем ДНК-полимеразы, и требования к химической чистоте всех ингредиентов, в том числе и меченых предшественников биосинтеза РНК, еще более жесткие.

Все фирмы-производители нуклеозид-5'трифосфатов, меченых фосфором-32 (или 33), поставляют эти соединения с добавками, снижающими химическую деструкцию веществ, обусловленную воздействием ионизирующего излучения, и в криостатах с сухим льдом (при -70°С). Такие добавки, "продлевающие" жизнь меченым соединениям, получили название радиопротекторов — по аналогии с веществами, снижающими вредное воздействие ионизирующего излучения на живые организмы. Каждый производитель использует свои, как правило, запатентованные радиопротекторы, продлевающие сроки использования меченых препаратов. Часто такие радиопротекторы (или их комбинации) окрашены в яркие цвета, что создает определенное удобство для работы — хорошо видно даже минимальный объем окрашенного меченого соединения. Естественно, что важнейшее требование к радиопротектору для меченых соединений в life science — это нетоксичность или "безвредность" самого радиопротектора и продуктов его радиолиза для тех биологических и ферментативных систем, в которых используется данный меченый препарат. Иными словами, радиопротектор не должен участвовать в биологическом процессе, который вы собираетесь изучать с помощью меченого соединения, содержащего радиопротектор. Соединения, меченные фосфором-32 или фосфором-33, которые производили и производят в России, окрашены за счет радиопротектора в ярко-красный цвет. При длительном хранении цвет будет "желтеть". Пожелтевший препарат лучше выбросить сразу — весь радиопротектор в таком препарате уже разрушился, и ничего хорошего от его радиоактивных остатков ждать не следует.

Вообще, саморадиолиз соединений, меченных фосфором-32 или фосфором-33, очень неудобное для работы явление, и его надо учитывать. Без радиопротекторов меченные фосфором-32 соединения в концентрированном растворе (более 15 мКи/мл) могут храниться очень недолго, а в сухом виде оставлять их дольше нескольких часов не следует, т.к. скорость химических превращений, под действием ионизирующего излучения в этом случае очень высокая.

Основное отличие фосфора-33 от фосфора-32 заключается в энергии β-излучения этих радионуклидов, т.к. различие в периоде полураспада менее чем в 2 раза несущественно. При этом преимущество более слабого излучения фосфора-33 (кроме психологического комфорта) проявляется только при необходимости авторадиографии с высоким разрешением близко расположенных меченых продуктов, например, автограф геля после электрофоретического разделения меченых фрагментов нуклеиовых кислот. Действительно, эффективность "ручного радиоактивного" сиквенса определялась разрешающей способностью электрофоретического разделения продуктов реакции терминации синтеза ДНК (в методе Сэнгера) или фрагментов химического расщепления [5'-32P]-одноцепочечной ДНК (по Максаму-Гилберту). Для 32Р-меченых фрагментов с одного геля квалифицированный специалист мог "прочитать" 350÷400 нуклеотидов. "Зубры" секвенирования ДНК в Москве и Новосибирске довели эту величину до 700 нуклеотидов. Однажды, автору этого обзора в новосибирском Академгородке с гордостью продемонстрировали автограф геля, с которого удалось "прочитать" почти 750 нуклеотидов. В научном фольклоре встречались даже более высокие величины (вплоть до 1000), однако, таких задокументированных результатов я не встречал. Переход на фосфор-33 только за счет более мягкого β-излучения сразу увеличивал разрешение в 1,5÷2 раза и, следовательно, повышал производительность труда при сиквенировании ДНК. Впрочем, автоматические секвенаторы ДНК, использующие флюоресцентную метку, полностью прекратили эту гонку за производительностью "ручного сиквенса" с использованием радиоактивных изотопов.

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5