Хромофоры белковых молекул (то есть химические группы в молекуле белка, ответственные за поглощение света на определенных длинах волн) можно разделить на три класса: пептидные группы, боковые группы аминокислотных остатков и простетические группы. Спектроскопические методы исследования вторичной структуры белка основаны на изучении спектров именно пептидных хромофоров, поскольку конформация пептидных групп и определяет тот или иной тип вторичной структуры белка - a-спираль, b-структуру и др. Изучение поглощения света пептидными группами белка обычно проводится в ультрафиолетовом и в инфракрасном диапазонах. Как показывают эксперименты, простая адсорбционная спектроскопия белков в неполяризованном ультрафиолетовом свете мало пригодна для анализа вторичной структуры белка. Более ценную информацию можно извлечь из спектров кругового дихроизма белка. Инфракрасные спектры поглощения белка также пригодны для анализа его вторичной структуры [1]. Ниже будет рассмотрено применение методов измерения кругового дихроизма и инфракрасной спектроскопии для анализа вторичной структуры белка.

1. Спектры кругового дихроизма белков

1.1 Явление кругового дихроизма

Белки, как практически все биологические молекулы, вследствие своей пространственной асимметрии обладают оптической активностью. При прохождении через оптически активную среду плоскополяризованный свет становится эллиптически поляризованным. Эллиптичность света q является одной из мер оптической активности. Она определяется как арктангенс отношения малой и большой осей эллипса. Другим параметром, характеризующим оптическую активность, является отклонение большой оси эллипса от направления поляризации падающего света, называемое оптическим вращением (или дисперсией оптического вращения) j.

Если представить плоскополяризованную волну Е в виде суммы двух волн противоположной круговой поляризации Е=ЕL+ЕR, то можно показать, что величина j пропорциональна разности показателей преломления среды для этих волн nL-nR, а величина q - разности коэффициентов экстинции eL-eR. Таким образом, оптическое вращение и появление эллиптической поляризации у плоскополяризованного света при прохождении его через оптически активную среду можно объяснить различным замедлением (nL¹nR) и поглощением (eL¹eR) двух его составляющих ЕL и ЕR, поляризованных по кругу. Разность Dn=nL-nR называют круговым двулучепреломлением, а разность De=eL-eR - круговым дихроизмом. Зависимости этих величин от длины волны называют спектрами дисперсии оптического вращения (ДОВ) и кругового дихроизма (КД).

На самом деле, ДОВ и КД являются проявлениями одного и того же физического явления, а их спектры можно выводить один из другого. Поэтому на практике достаточно измерять лишь один из этих двух спектров. Спектры КД более удобны для использования на практике, поскольку содержат узкие, хорошо разрешимые полосы. Этим объясняется то, что в настоящее время метод измерения КД используется гораздо более широко, чем ДОВ, несмотря на то, что он требует гораздо более сложного экспериментального оборудования.

КД легко измерить путем попеременного пропускания через образец лево - и правополяризованного по кругу света и регистрации соответствующей разницы поглощений, поскольку эллиптичность выходящего из оптически активного образца света обычно очень мала, и ее точное измерение весьма затруднительно. Однако, разность поглощений обычно пересчитывают в значения эллиптичности. Для того, чтобы можно было сравнивать результаты, полученные при исследовании разных образцов, пользуются значениями так называемой молярной эллиптичности:

[q] = 100q / Cl = 3300 De, (1.1.1)

где С - молярная концентрация, а l - длина оптического пути.

В случае белков главной целью измерения спектров КД является определение содержания в них вторичных структур разных типов. Если доля ароматических аминокислот в белке не очень велика, его оптическая активность в области от 180 до 240 нм определяется главным образом полипептидным остовом. Многочисленные эксперименты показали, что алифатические боковые группы аминокислотных остатков белка также не дают заметного вклада в спектр КД в этой области. Следовательно, в первом приближении белковую молекулу можно рассматривать просто как комбинацию участков полипептидным остова, находящихся в конформациях a-спирали, b-структуры и беспорядочного клубка.

Поглощение света пептидной группой

в ультрафиолетовом диапазоне определяется электронными переходами в ее электронных оболочках. В этом процессе основное участие принимают три молекулярных орбитали пептидной группы: n-орбиталь - несвязывающая орбиталь, на которой располагается неподеленная пара 2py-электронов атома кислорода, p-орбиталь - связывающая орбиталь, на которой располагаются 2pz-электрон атома кислорода и 2pz-электрон атома углерода, в значительной степени делокализованные по атомам кислорода, углерода и азота, и p*-орбиталь - разрыхляющая орбиталь, на которой в основном состоянии электроны отсутствуют. Два электронных перехода с наименьшей энергией наблюдаются при возбуждении электрона с n-орбитали на p*-орбиталь (n®p* переход) и с p-орбитали на p*-орбиталь (p®p* переход). n®p* переходу в пептидах соответствует слабая полоса поглощения 210-220 нм, а p®p* переходу гораздо более сильная полоса с максимумом вблизи 190 нм (характерная для a-спиральной конформации).

КД различных типов вторичной структуры белка можно оценить по результатам измерения КД гомополипептидов известной конформации (например, поли-L-лизина), после чего определить вклад каждой из структур в спектр КД исследуемого белка. Однако, такой подход имеет ряд больших недостатков. Во-первых, участки упорядоченной вторичной структуры модельных гомополипептидов имеют значительно большую длину, чем длина типичных участков в глобулярных белках. Во-вторых, их конформация может сильно отличаться от конформации, наблюдаемой у элементов вторичной структуры реальных белков. Кроме этого, среди гомополипептидов нельзя найти "стандартов" для b-изгибов. И, наконец, хотя вклад в КД от взаимодействий между хромофорами уменьшается как квадрат расстояния между ними, должен существовать определенный вклад от взаимодействия между участками с различной вторичной структурой. Эти взаимодействия нельзя адекватно смоделировать, рассматривая протяженные гомополимеры. Поэтому на практике спектры КД гомополипептидов не используются. Вместо этого в качестве базисных берут спектры КД белков, структура которых известна из данных рентгеноструктурного анализа. Различные подходы к анализу исследуемого спектра КД на основе этого базисного набора определяют различия между методами, которые будут описаны ниже.

1.2 Методы анализа спектров кругового дихроизма белков

Метод "эталонных спектров" [2,3]. Методы предсказания вторичной структуры белков по их спектрам КД основаны на предположении о том, что спектры КД различных структурных форм, составляющих белковую молекулу, дают аддитивный вклад в спектр КД белка в целом. Это можно записать в следующем виде:

(1.2.1)

где - спектр КД белка (зависимость эллиптичности от длины волны света), - идеализированный "эталонный спектр" - спектр КД, соответствующий i-ой структурной форме, участвующей в образовании вторичной структуры белка, - доля этой формы во вторичной структуре, причем

и. (1.2.2)

Эталонные спектры для всех структурных форм могут быть вычислены на основании набора базисных спектров КД (спектров белков с известной вторичной структурой - коэффициентами ) с помощью метода наименьших квадратов и формулы (1.2.1), примененной к каждому базисному спектру. После этого экспериментальный спектр КД исследуемого белка с помощью того же метода наименьших квадратов может быть аппроксимирован по формуле (1.2.1) с использованием вычисленных эталонных спектров. При этом вклад каждого из эталонных спектров будет равен доле соответствующей ему структурной форме в общей структуре белка Такой подход к анализу спектров КД белков был впервые использован в работе [2]. Ниже будет более подробно рассмотрена модификация этого метода [3].

Принимая в рассмотрение в качестве структурных классов a-спираль (H), b-структуру (b), b-изгиб (t) и “неупорядоченную” форму (R), можем написать:

. (1.2.3)

Суммируя экспериментальные данные, вместо в уравнение (1.2.3) вводят величину , учитывающую зависимость эталонного спектра, соответствующего a-спирали, от числа аминокислотных остатков, образующих ее:

, (1.2.4)

где и - эталонные спектры для a-спирали из n аминокислотных остатков и для a-спирали “бесконечной” длины, а k - так называемый фактор длины цепи (). Согласно теоретическим расчетам оптической активности a-спирали и экспериментальным данным, спектр КД a-спирали в диапазоне 185-240 нм может быть разложен на три независимых оптически активных составляющих (n®p*, p®p||*, p®p^*), которые можно описать гауссовскими зависимостями:

, (1.2.5)

где и - положение максимума и полуширина j-ой гауссовской линии в спектре КД a-спирали, а - максимальное значение эллиптичности “бесконечной” a-спирали на длине волны . В окончательном виде для спектра КД белка можно написать следующее выражение:

, (1.2.6)

где

. (1.2.7)

Здесь - среднее число аминокислот на a-спиральный участок цепи в молекуле белка.

Параметры , , и в уравнении (1.2.7) были найдены на основе спектра КД миоглобина. Они имеют следующие значения:

j	, нм	, нм	, град×см2×дмоль-1
1	223.4	10.8	-3.73×10	2.50
2	206.6	8.9	-3.72×10	3.50
3	193.5	8.4	+10.1×10	2.50

Эти параметры для глобулярных белков с достаточно большой точностью можно считать постоянными. Попытки оценить для конкретных белков по их спектрам КД оказались ненадежными. Для большинства исследованных белков этот параметр оказался равным примерно 10-11 аминокислотам на a-спиральный сегмент. Распространяя этот факт на все анализируемые белки, авторы данного метода положили равным 10.

Вклад b-структуры в спектр КД белка оказывается зависящим от гораздо большего числа параметров: не только от числа аминокислотных остатков на сегмент, но и от числа нитей в данном участке структуры и их направленности, поэтому его описание простым уравнением, подобным уравнению (1.2.7), невозможно. То же самое касается b-изгиба и, особенно, “неупорядоченной” формы, под которой подразумевается все, не относящееся к другим классам. Используемые в данном методе эталонные спектры b-структуры, b-изгиба и “неупорядоченной” формы являются статистически усредненными по белкам, используемым в качестве базисных.

Процедура анализа спектра КД исследуемого белка подразделяется на два этапа. Первый этап заключается в вычислении эталонных спектров структурных элементов, то есть значений , , и для длин волн в диапазоне 185-240 нм с интервалом в 1 нм, на основе экспериментальных спектров КД пятнадцати эталонных белков со значениями , , , , , известными из рентгеноструктурного анализа. Эталонный спектр, соответствующий a-спирали, может быть вычислен непосредственно по формуле (1.2.7). Остальные эталонные спектры находятся из уравнения (1.2.6) с помощью метода наименьших квадратов, причем для уменьшения числа неизвестных в этом уравнении из экспериментального спектра КД каждого эталонного белка исключается вклад a-спиральной формы, вычисленный по формуле (1.2.7). Эталонные спектры, вычисленные с помощью данного метода показаны на рисунке 1.2.1.

Когда эталонные спектры найдены, могут быть вычислены коэффициенты , , , в уравнении (1.2.6), примененном к спектру КД исследуемого белка. Для этого также используется метод наименьших квадратов. Он заключается в подборе таких коэффициентов , что

minimum. (1.2.8)

Здесь - экспериментальный, а - рассчитанный по формуле (1.2.6) спектр КД исследуемого белка; - число точек в спектре. Коэффициенты , являющиеся решением уравнения (1.2.8) с учетом условий (1.2.2), представляют собой искомые доли структурных элементов во вторичной структуре белка.

Метод "регуляризации" [4].Подход к анализу спектра КД белка, лежащий в основе предыдущего метода, заключается в определении эталонных спектров, которые, как можно было бы предполагать, полностью характеризуют структурные элементы, образующие вторичную структуру исследуемого белка. Однако, как показывают экспериментальные данные, ни один эталонный спектр не может точно описать все разновидности таких обширных и достаточно неопределенных классов, как a-спираль, b-структура, b-изгиб и др.

Конформация элементов вторичной структуры глобулярных белков значительно отличается от идеальной. Кроме этого, вклад каждого структурного класса в спектр КД белка зависит от очень многих параметров, о которых упоминалось выше. Для учета всего разнообразия типов вторичной структуры белков требуется расширить исходный набор базисных спектров. В результате возникающей при этом избыточности начальных данных обычный метод наименьших квадратов становится неустойчивым к экспериментальной ошибке и приводит к заведомо неверным результатам. Применение метода "эталонных спектров" в том виде, как он описан в предыдущем пункте, к большому базисному набору спектров оказывается, по сути, некорректным.

Эту проблему частично можно разрешить, заменив метод наименьших квадратов моделью, применение которой, на первый взгляд, не вполне оправдано и адекватно, но зато приводит к устойчивому к экспериментальной ошибке результату даже в случае большого числа параметров. Применение такой стабилизирующей модели позволяет подойти к анализу спектров КД с другой стороны. А именно, появляется возможность прямого представления спктра КД исследуемого белка в виде линейной комбинации базисных спектров. Таким образом удается полностью избежать проблемы, связанной с определением эталонных спектров отдельных структурных классов и проводить более гибкий и точный анализ с использованием реальных белковых спектров.

Рассмотрим данный метод более подробно. Предположим, что нам удалось представить спектр КД исследуемого белка в виде линейной комбинации спектров базисных белков, структура которых известна из рентгеноструктурного анализа. Обозначим число этих спектров через (в данном методе =16). Тогда можем записать:

Страницы: 1, 2, 3, 4

Новости

Мои настройки

Наверх