• Главная
• Юридпсихология
• Этика эстетика
• Электротехника
• Эктеория
• Физика
• Управление персоналом
• Уголовный процесс
• Уголовное право
• Схемотехника
• Стратегический менеджмент
• САПР
• Ресторанно-гостиничный бизнес бытовое обслуживан
• Реклама и PR
• Режущий инструмент
• Неопределено
• Метрология
• Матметоды в эк-ке
• Исторические личности
• Искусство и культура
• Информатика
• Иностранные языки
• Гражданское процессуальное право
• Гражданское право
• Государственное регулирование и налогообложение
• Сонник
• Карта сайта

Состояние глутатионового звена антиоксидантной системы крови практически здоровых людей с лор-патало...
Глутатион-S-трансфераза входит в семейство ферментов, нейтрализующих токсическое влияние различных гидрофобных и электрофильных соединений путем их коньюгации с восстановленным глутатионом, GST локализованы преимущественно в цитозоле клеток. Основная функция GST-защита клеток от ксенобиотиков и продуктов ПОЛ посредством их восстановления, присоединения к субстрату молекулы глутатиона или нуклеофильного замещения гидрофобных групп: ROOH + 2GSH → ROH + GSSG + H2O R + GSH → HRSG RX + GSH → RSG + HX GST способны восстанавливать гидроперокси-группы окисленных фосфолипидов непосредственно в мембранах без их предварительного фосфолипидного гидролиза свободными жирными кислотами. Этот фермент конъюгирует с GSН токсичные продукты ПОЛ (ноненали, децинали, холестерин-α-оксид) и тем способствуют их выведению из организма. Таким образом, GST является важным компонентом антиоксидантной защиты, особенно от эндогенных метаболитов, образующих при окислительном стрессе [Владимиров, 1998]. Глутатионредуктаза. Во многих реакциях, катализируемых GPO и GST, две молекулы GST соединяются дисульфидной связью и образуют окисленный глутатион. Для восстановления GSSG в клетках существует специальный фермент – глутатионредуктаза [Зенков, Меньщикова, 2004]. ГР широко распространенный флавиновый фермент, поддерживающий высокую внутриклеточную концентрацию GSH, катализируя обратимое NFDFH– зависимое восстановление GSSG с образованием двух молекул GSH. GSSG + NADFH + H+ → 2GSH + NADF+ ГР содержится в основном в растворимой части клетки. Глюкоза-6-фосфатдегидрогеназа. Для восстановления окисленного глутатиона ГР в качестве донара водорода используется NADFH, который образуется в пентозофосфатном пути в ходе глюкозо-6-фосфатдегидрогеназной реакции [Андреев, 1999] G6FD – фермент, катализирующий начальную реакцию пентозофосфатного пути: восстановление глюкозо-6-фосфата в 6-фосфоглюконат. Она состоит из двух типов субъединиц, которые состоят из 479 аминокислотных остатков, имеют один и тот же СООН - концевой участок, но разные NH2-концы, Эти субъединицы различаются по длине и последовательности аминокислот. Реакцию, катализируемую G6FD, с кинетической точки зрения можно рассматривать как двухсубстратную реакцию, протекающую с участием субстрата и кофермента, выполняющего роль второго субстрата. Фермент очень сильно ингибируется NADFH и ATF, по типу конкурентного ингиирования. Глутатион – трипептид (L-γ-глутамил-L-цистеинилглицин), который при физиологических значениях рН имеет две отрицательно заряженные карбоксильные группы и положительно заряженную аминогруппу. Наличие γ-глутамильной связи защищает трипептид от деградации внутриклеточными пептидазами, а сульфгидрильная группа цистеина может служить донором электронов, придавая глутатиону свойства восстановителя и способность удалять свободные радикалы. Одноэлектронная реакция GSH со свободными радикалами приводит к образованию тиильного радикала GS., который при димеризации с другим GS. радикалом дает дисульфид глутатиона (GSSG). Второй тип окислительно-восстановительных реакций, в которых принимает участие глутатион - это реакции тиол-дисульфидного обмена [Brune,1995]. При окислительно-восстановительных реакциях третьего типа происходит двухэлектронное окисление с образованием интермедиата, который затем реагирует со второй молекулой, идентичной первой или отличной от нее. При этом в первом случае образуется GSSG, а во втором-смешанный дисульфид. В клетках всех типов GSH синтезируется в ходе двух последовательных реакций, катализируемых γ-глутамилцистеинсинтетазой (γ-GCS) и GSН-синтетазой (GS). γ-GCS катализирует образование пептидной связи между γ-карбоксильной группой глутамата и α-аминогруппой цистеина. Глутатионсинтетаза образует пептидную связь между α-карбоксильной группой цистеина в составе γ-глутамилцистеина и α-аминогруппой глицина. Обе реакции являются ATF-зависимыми, имеют сходный каталитический механизм и протекают через образование ацилфосфатного интетрмедиата [Davies,1995]. Статус глутатиона определяется как общая концентрация глутатиона и количественное соотношение между различными формами, в которых он существует в клетке. Статус глутатиона обусловлен динамическим равновесием между реакциями синтеза, деградации, транспорта, окисления и восстановления и поэтому может изменяться в зависимости от преобладания тех или иных реакций, что определяется состоянием клетки и окружающей среды. Изменение статуса GSH может наблюдаться как при нормальных физиологических ситуациях, так и при стрессах. Для ингибирования синтеза GSH у эукариот широко используется ингибитор γ-глутамилцистиинсинтетазы [Gebhardt,1984]. Редокс-активность глутатиона при одновременной его устойчивости к окислению кислородом, высокая концентрация и возможность поддержания в восстановленном состоянии делают GSH важнейшим внутриклеточным редокс-буфером. Редокс система глутатиона включает в себя сам глутатион, GPO и ГSТ [Davies,1995]. GSH реагирует с очень большим числом электрофильных компонентов с образованием GSH-конъюгатов. Эта реакция может происходить спонтанно или катализироваться ферментами GSТ, затем коньюгаты деградируют до относительно безвредных меркаптуровых кислот. Глутатион также участвует в детоксикации некоторых реактивных альдегидов, которые могут образовываться при окислительных процессах в клетках. У эукариот глутатион играет ключевую роль в защите от окислительного стресса как кофактор селенозависимых и независимых GPO (Рис. 2). При окислительном стрессе идет интенсивное окисление GSH, и снижение соотношения GSH/GSSG является одним из основных признаков окислительного стресса в клетках [Brune,1995]. Защита живых организмов от окислительных повреждений не ограничивается рассмотренными выше антиоксидантными системами, а осуществляется так же большим количеством репарационных систем, специфическими протеолитическими ферментами; макрофагами и гепатоцитами, эффективно захватывающими окисленные липопротеины через специальные «скэвенджнр-рецепторы». Эта еще раз свидетельствует о важности и сложности окислительных процессов с участием АФК, протекающих в живом организме. ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ   2.1. Объект исследования Объектом исследования явились эритроциты крови практически здоровых людей, проживающих в Советском и Октябрьском районах г. Красноярска, а так же эритроциты крови людей с ЛОР-патологиями. Всего обследовано 131 человек в возрасте от 18 до 54 лет, забор материала исследования проводился в клиническо-диагностической лаборатории ГУ НИИ медицинских проблем Севера СО РАМН. Группу контроля составили 102 практически здоровых человека, неболевших острыми респираторными заболеваниями в течение последнего месяца и не имеющих хронических ЛОР-заболеваний. Здоровые люди были отобраны в 2-х районах города Красноярска ЛОР-врачом по данным клинического осмотра. Группа людей с ЛОР-заболеваниями составила 29 человек, проживающих в различных районах г. Красноярска. Таблица 1 Характеристика материала исследования и объёма проведенных работ
Методы исследования	Здоровые	ЛОР-больные	Всего
Определение содержания GSH в эритроцитах крови Определение активности GPO в эритроцитах крови Определение активности GST в эритроцитах крови Определение активности GR в эритроцитах крови Определение содержания гемоглобина в эритроцитах крови	91 89 90 67 91	29 20 28 6 29	120 109 118 73 120
Всего	428	112	540

Определение активности глутатионзависимых ферментов – GPO, GST и GR, а так же содержание GSH проводили в упакованных эритроцитах крови (табл. 1).

2.2. Приготовление эритроцитов

Гепаринизированную кровь центрифугируют 20 минут при 3000 об/мин. (1700g). После центрифугирования убирают слой плазмы и тонкую белую лейкоцитарную пленку. Плазму отбирают отдельно и сохраняют. Оставшуюся после отбора плазмы эритроцитарную массу трижды отмывают физиологическим раствором (0,9%-ным NaCl) и центрифугируют по 15 минут при 3000 об/мин. (1700g). Супернатант отбрасывают. Последнее центрифугирование проводят в течение 20 минут для более плотной упаковки клеток [Авраамова, Титова, 1978].

2.3. Определение содержание гемоглобина

Содержание Hb определяют унифицированным гемиглобинцианидным методом с использованием набора реактивов фирмы “Агат-Мед”.

Принцип метода заключается в следующем: Hb крови при взаимодействии с железосинеродистым калием (красная кровяная соль) окисляется в Met-Hb, образующий с ацетонциангидрином гемиглобинцианид (цианметгемоглобин), оптическая плотность которого при 540 нм пропорциональна концентрации Hb в образце крови [Меньшиков, 1987]. Содержание Hb в опытных образцах выражали в граммах на литр упакованных эритроцитов.

Реактивы:

1. Трансформирующий реагент – сухая смесь натрий углекислый кислый, 1,0г, калий железосинеродистый, 200 мг.

2. Ацетонциангидрин.

3. Калибровочный раствор гемоглобин с концентрацией 120 г/л.

Ход определения

К 5 мл трансформирующего раствора добавляют 0,02 мл крови (разведение в 251 раз) или гемолизата, хорошо перемешивают. Определение проводят через 10 минут против холостой пробы (трансформирующего раствора), окраска устойчива в течение не менее 1 часа.

При использовании фотоколориметра определение проводят в диапазоне длин волн 500-560 нм (зелёный светофильтр). Калибровочный раствор гемоглобина обрабатывают также, как и пробу цельной крови. Расчёт содержания гемоглобина производят по формуле:

,

где:

Hb – содержание гемоглобина в опытной пробе, г/л;

Dо – оптическая плотность опытной пробы;

Dx – оптическая плотность калибровочной пробы;

120 – содержание гемоглобина в калибровочном растворе, г/л.

2.4. Определение количества восстановленного глутатиона

Принцип метода основан на взаимодействии GSH с ДТНБК (5,5’-дитио-бис-2-нитробензойной кислотой) с образованием окрашенного в желтый цвет аниона 2-нитро-5-тиобензоата. Увеличение концентрации желтого аниона в ходе данной реакции регистрировали спектрофотометрически при длине волны 412 нм [Beutler, 1990].

Ход определения

Готовим гемолизат добавлением 0,2 мл отмытых от плазмы и упакованных эритроцитов к 1,8 мл дист. Н2О, охлаждённой до 0ºС. Для осаждения белков к гемолизату добавляли 3 мл осаждающего раствора. Пробы тщательно перемешивали и после 20 минутного стояния при комнатной температуре фильтровали через крупнопористый фильтр. Фильтрат должен быть прозрачным и бесцветным. 1 мл фильтрата помещали в спектрофотометрическую кювету объёмом 3 мл, добавляли 4 мл фосфатного буфера. Затем в пробу вносили 500 мкл раствора ДТНБК. Сразу же после перемешивания должна появиться жёлтая окраска из-за образования дисульфида глутатиона с ДТНБК. Пробу фотометрировали при длине волны 412 нм в кювете с толщиной слоя 1,0 см. Поскольку раствор ДТНБК имеет слабожелтую окраску, параллельно с опытной пробой готовили контрольную, содержащую вместо фильтрата осаждающий раствор, разведённый дист. Н2О в отношении 2:5.

Реактивы:

1. Осаждающий раствор: 1,67 г ледяной ортофосфорной кислоты, 0,2 г ЭДТА и 30 г хлористого натрия растворяли в дист. Н2О и доводили до метки 100 мл.

2. Фосфатный буфер: 0,3 М Na2HPO4

3. ДТНБК: 0,02%-ный раствор, приготовленный на 1%-ном растворе цитрата натрия

Содержание восстановленного глутатиона рассчитывали с учетом коэффициента молярной экстинкции (13600 М-1´см-1) окрашенного аниона, образующегося при взаимодействии GSH с ДТНБК и выражали в мкмоль на грамм Hb.

Содержание глутатиона рассчитывают по формуле:

,

где:

С – концентрация восстановленного глутатиона, мкмоль/г Hb;

Е1 – оптическая плотность опытной пробы до добавления ДТНБК;

Е2 – оптическая плотность опытной пробы после добавления ДТНБК;

138 – разведение эритроцитов в реакционной пробе;

Hb – гемоглобин, г/л;

1000 – коэффициент для пересчета концентрации глутатиона от молярной к миллимолярной;

F – отношение оптической плотности контрольной пробы до добавления ДТНБК (Е1 ) и после добавления (Е2 );

13600 – коэффициент молярной экстинции окрашенного катиона, образующегося при взаимодействии GSH с ДТНБК;

2.5. Определение активности глутатионпероксидазы

Принцип метода: глутатионпероксидаза катализирует реакцию взаимодействия GSH с гидроперекисью трет-бутила (ГПТБ). Активность фермента при этом может быть оценена по изменению содержания GSH в пробах до, и после инкубации с модельным субстратом в ходе цветной реакции с ДТНБК [Paglia, Valentine, 1967].

Ход определения

Отмытые и упакованные эритроциты гемолизировали охлаждённой до 0ºС водой в соотношении 1:200. 0,2 мл гемолизата смешивали с 0,73 мл сложного буфера и термостатировали 10 мин при 37°С. Реакцию инициировали внесением в реакционную смесь 0,07 мл 0,14%-ного раствора ГПТБ (коммерческий препарат). Строго по секундомеру через 5 мин инкубации при 37°С реакцию останавливали добавлением 0,2 мл 20%-ного раствора ТХУ. В контрольные пробы 0,14%-ный раствор ГПТБ вносили после осаждения белка ТХУ. Полученные пробы центрифугировали при 1700g в течение 10 мин. Супернатант использовали для определения количества восстановленного глутатиона: к 0,1 мл супернатанта добавляли 2,65 мл 0,1 М трис-HCl буфера. После перемешивания пробы фотометрировали на СФ-26 при длине волны 412 нм в кювете с длиной оптического пути 1,0 см против дист. Н2О. Активность фермента в эритроцитах выражали в мкмолях GSH, окисленного за 1 минуту на грамм Hb, используя коэффициент молярной экстинкции (13600 М-1´см-1) окрашенного аниона, образующегося при взаимодействии GSH с ДТНБК.

Реактивы:

1. Сложный буфер: 0,1М Трис-HCl-буфер, pH8,5, содержащий 6мМ ЭДТА и 12мМ азид натрия. Непосредственно на этом буфере готовят 4,8 мМ раствор GSH

2. 0,14%-ный раствор трет-бутил гидропероксида

3. 20%-ный раствор ТХУ

4. 0,1 М трис-HCl буфер, pH8,5

5. ДТНБК на абсолютном метаноле, 0,01М

Активность рассчитывают по формуле:

,

где:

А - активность фермента, мкмоль/мин×л;

∆С – разность концентраций GSH в опытной и контрольной пробах;

Vпр. – объем пробы, используемый для определения концентрации GPO

t – время инкубации;

Vр.с..- объем реакционной смеси;

201 – степень разведения эритроцитов в гемолизате;

1000 – коэффициент для пересчета активности GPO от молярной к миллимолярной;

Hb – гемоглобин г/л;

Активность GPO можно также выразить в мкмоль\мин на 1 г Hb

2.6. Определение активности глутатион-S-трансферазы

Принцип метода: активность глутатион-S-трансферазы определяли по скорости образования глутатион-S-конъюгатов между GSH и 1-хлор-2,4-динитробензолом (ХДНБ).

Увеличение концентрации конъюгатов в ходе реакции регистрировали спектрофотометрически при длине волны 340 нм (максимум поглощения глутатион -S- ХДНБ) [Habig et al., 1974].

Ход определения

Источником фермента служил осмотический гемолизат, который готовили добавлением к одному объему упакованных эритроцитов двадцати объемов дист. Н2О, охлажденной до 0°С. В кювету с длиной оптического пути 1,0 см, содержащую 2,5 мл 0,1 М калий-фосфатного буфера рН=6,5, добавляли 0,2 мл 0,015 М раствора восстановленного глутатиона и 0,1 мл гемолизата. Реакцию инициировали внесением в кювету 0,2 мл 0,015М ХДНБ (готовили на абсолютном метаноле). Параллельно опытной готовили контрольную пробу, в которую вместо гемолизата вносили дист. Н2О. Регистрацию оптической плотности проводили при t=25°C и длине волны 340 нм против воды сразу после перемешивания в течение трех минут. Активность фермента рассчитывали, используя коэффициент экстинкции для ГS-ХДНБ при длине волны 340 нм, равный 9,6 мМ-1*см-1, и выражали в ммолях образующихся глутатион S-конъюгатов в минуту на грамм Hb.

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5